近年来，随着水体环境的变化，江河湖海的营养化日趋严重，水质富营养化引发藻华爆发及水环境安全问题^[1]，现已有大量的研究及有意义的成果^[2-7]，如提出了氮、磷等常量元素对藻华爆发的影响以及藻华爆发的生长模型等。近年来微量金属元素的关键性作用开始逐渐成为藻华爆发预警领域的研究热点问题，并有专家提出了铁限制学说等一些新的理论。

现有关于Fe对浮游植物影响的大量研究工作都集中在海洋领域，随着湖泊富营养化导致的水华暴发频率和危害日益增大，以及海洋领域关于Fe限制研究工作的逐渐深入，Fe对淡水浮游藻类生理生态的影响也引起越来越多科学工作者的关注^[8-14]。与N、P、Si三大生源要素一样，Fe在浮游植物代谢中生物能的形成过程中起着重要作用^[9-10]。目前有关淡水湖泊中Fe限制的报道还较少，阎峰等^[15]的一些现场试验和室内模拟实验表明Fe同样能对淡水藻类的生长和群落结构产生一定的影响。水华鱼腥藻是我国南方水体的常见藻种，也是蓝藻藻华的典型藻种。

本文选取水华鱼腥藻为研究代表，研究常见的4种络合态铁(柠檬酸铁铵、EDTA-铁、草酸铁、腐殖酸铁)对藻类生长的影响，尝试从微量元素营养基质的角度探讨藻华暴发的成因和规律，为水体富营养化防治和藻华控制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要仪器与设备

SC-3610低速离心机，安徽中佳科学仪器有限公司；T6紫外可见分光光度计，北京谱析通用仪器有限责任公司；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海中安医疗器械厂；PHS-3B雷磁pH计，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 藻种

本实验选取代表藻种水华鱼腥藻为实验藻种，该藻种购自中国科学院武汉水生生物研究所。水华鱼腥藻编号为FACHB-245。

1.3 实验方法

水华鱼腥藻实验前用标准BG-11培养基接种扩大培养，在对数增长期时离心收集藻细胞(5 000 r/min，15 min)，用缺铁BG-11培养基饥饿培养2 d，剔除原培养基中残留铁的影响。取饥饿培养后藻液接种到BG-11改良培养基中，改良培养基以柠檬酸铁铵、EDTA-Fe、草酸铁、腐殖酸铁充当铁源，分别控制TN、TP质量浓度为10 mg/L和1.1 mg/L，柠檬酸铁铵、EDTA-Fe、草酸铁、腐殖酸铁以质量浓度梯度为0.2 mg/L波动，从0.2 mg/L到1.0 mg/L，所有营养物质一次加入，实验周期内不再补充。控制接种水华鱼腥藻生物量约为5×10⁶个/L。光照强度为2 000 lx，温度为25 ℃，光暗时间比为12:12，每天定时摇晃锥形瓶2-3次，减少器壁效应，并变换位置，以减少光照影响。

1.4 测试方法

取一定量水华鱼腥藻藻液，按不同倍数稀释后，分别测定其在680 nm处的吸光度值(A₆₈₀)。另从稀释后的藻液中取0.5 mL滴入载玻片上，染色固定后，在10×20倍显微镜下计数，同步做3个平行样。生物量用3个平行样的平均值表示，做水华鱼腥藻生物量(N)与吸光度(A₆₈₀)的标准曲线，拟合式为式(1)，并计算藻生长速率。试验期间，每天9:00定时用分光光度法检测吸光度(A₆₈₀)，再根据式(1)换算出生物量。

$N = 4 \times {10^{ - 6}}{{A}_{680}} + 0.046,{\text{相关系数}}{R^2} = 0.995.$

(1)

式(1)中，N为水华鱼腥藻生物量，个/L；A₆₈₀为680 nm处水华鱼腥藻的吸光度值，Abs。

比增长速率按下式计算^[16]：

$\mu = \frac{{\ln {N_2} - \ln {N_1}}}{{{t_2} - {t_1}}},$

(2)

式(2)中，μ为比增长速率，d^–1；t₁、t₂为培养时间，d；N₁、N₂为t₁、t₂时的藻生物量。

2 结果与分析 2.1 不同络合态铁对水华鱼腥藻增殖趋势的影响的对比分析

柠檬酸铁铵、EDTA-Fe、草酸铁、腐殖酸铁在同一浓度下对水华鱼腥藻的增殖趋势见图1~图5。如图1所示，在初始质量浓度为0.2 mg/L时，柠檬酸铁铵组生物量增长明显，到第20 d时达到1.45×10⁸个/L；腐殖酸铁组、EDTA-Fe组、草酸铁组曲线斜率变化相似，藻生物量增加水平相当，相比之下，腐殖酸铁藻生物量增加最多。由图2可知，在初始质量浓度为0.4 mg/L时，前6 d，4种络合态铁组曲线斜率相似，都较小，藻生物量缓慢增加；到第8 d，曲线坡度变陡，草酸铁组曲线斜率相对较小，藻生物量达到4.5×10⁷个/L，腐殖酸铁组与EDTA-FE组曲线相近，腐殖酸铁稍比EDTA-Fe藻生物量增长得快，柠檬酸铁铵组虽然在第14 d时增幅有所回落，但藻生物量始终处于增加状态，并在4组中长势最好。如图3所示，当初始质量浓度为0.6 mg/L时，培养前期8 d，柠檬酸铁铵组、EDTA-Fe铁组、草酸铁组曲线斜率较小，藻生物量缓慢增加，而腐殖酸铁组藻生物量缓慢增长至第10 d；第8 d后，柠檬酸铁铵组明显长势最好，藻生物量快速上升，第20 d时达到1.03×10⁸个/L，EDTA-Fe组紧随其后，藻生物量达1.0×10⁸个/L；草酸铁组与腐殖酸铁组在12 d时藻生物量相当，随着培养周期延长，各自以不同的速度增长，草酸铁组达7.2×10⁷个/L，腐殖酸铁组达到6.5×10⁷个/L。如图4所示，当初始质量浓度为0.8 mg/L时，培养前期，4组藻生物量增长均平缓；培养中期，柠檬酸铁铵组与EDTA-Fe组曲线斜率都发生较大变化，曲线坡度变陡，藻生物量迅速增加，到20 d藻生物量几乎相同，较之，腐殖酸铁组与草酸铁组一直保持平稳缓慢增长。由图5可知，当初始质量浓度为1.0 mg/L时，柠檬酸铁铵组长势最为迅猛，生长曲线斜率较大，藻生物量达到8.7×10⁷个/L；EDTA-Fe组藻生物量增长速度不稳定，但总体呈上升趋势，有突然加速的时间段，藻生物量增长最终与柠檬酸铁铵大致相同；草酸铁组始终以较为平稳的速度增长，藻生物量增加数目最少；腐殖酸铁组曲线斜率介于草酸铁组与EDTA-Fe组之间，增长速度稳定，至培养第20 d，藻生物量达7.5×10⁷个/L。

从前面数据可知，不同的络合态铁和不同的浓度条件都会对水华鱼腥藻增殖过程产生影响，且影响规律不尽相同。在低质量浓度(0.2 mg/L)时，柠檬酸铁铵的藻生物利用性优于其他3种络合态(图1)；随着质量浓度的升高(0.4 mg/L)，EDTA铁和草酸铁的藻生物铁可利用性增强，与柠檬酸铁铵趋势相近(图2)；质量浓度进一步升高(0.6~1.0 mg/L)，4种络合态铁的藻增殖趋势相近，但藻峰值不同(图3~图5)。

分析认为，络合态铁的藻可生物利用性与络合形态密切相关。络合态铁在水中存在化学平衡，不同络合态铁在水中的络合常数不同，即络合态铁在水中的稳定性不同，导致水华鱼腥藻对不同络合态铁中铁的吸收有所差异。络合态铁的稳定性的影响因素分为内因和外因，其中实验条件严格控制一致，外因的影响很小，认为可忽略；内因包括中心离子(铁离子)的影响和有机试剂分子的影响。铁离子是未充满d电子层轨道和f电子层轨道的过度金属离子，它的络合物形成具有部分共价键的性质，对O和N的配位能力相近，与含有羟基的有机试剂能形成稳定的络合物。本实验选用的4种有机络合剂都含有羟基并且都能与铁离子形成共价键，因此稳定性的差异很有可能发生在络合剂分子结构上。如草酸铁是3个草酸与2个三阶铁离子络合而成的(图6(a))，结果较为稳定，络合物中的铁不容易被藻体分泌的络合剂抢夺吸收。这个就解释了草酸铁组的水华鱼腥藻始终不占优势的现象。而EDTA-Fe铁组中，EDTA与铁络合形成环状结构(图6(b))，铁不容易解离被藻体吸收。柠檬酸铁铵组也符合这个规律，柠檬酸与铁铵形成络合物只是铁铵简单地取代羟基中的氢(图6(c))，因而比较容易被其他强的络合剂抢夺，所以柠檬酸铁铵组在低浓度时也能被较好地利用。因此，水华鱼腥藻能够吸收的铁难易程度有所不同，导致藻生长情况不同。

图1~图5同时表明，在同一浓度下，不同络合态铁对水华鱼腥藻生长规律的影响不同。原因如下：(1) 不同络合态铁的螯合铁量不同。如草酸有2个铁的络合位点而EDTA有6个络合位点，柠檬酸则有4个铁的络合位点；即使位点个数相同，但铁离子不一定能与位点一一对应结合。如柠檬酸，虽有4个络合位点，但一般情况下只络合一个铁铵离子。所以，即使是同一浓度，不同络合态铁的铁含量有所差异，导致藻类对铁的吸收利用规律有所不同。(2) 不同络合态铁在水中的稳定性不同，也会影响藻类对铁的吸收利用。

这个结论，对探索藻可利用铁吸收途径的微观问题有重要意义，认为水华鱼腥藻吸收络合态铁的途径是“络合态铁迁移到藻细胞表面——解络合——进入细胞——藻吸收利用合成”，络合剂与铁离子络合结构的不同导致了稳定性的差异，中间步骤的难易程度影响了藻类对铁的吸收，从而影响了铁的藻生物可利用性。

2.2 水华鱼腥藻的最适生长络合态铁浓度分析

不同初始浓度下不同络合态铁对水华鱼腥藻藻峰值影响见图7~图10。由图可知，随着铁质量浓度的增加，柠檬酸铁铵组水华鱼腥藻藻峰值变化较大，在质量浓度0.2 mg/L时达到最大值，约为1.45×10⁸个/L，之后在质量浓度0.4 mg/L处有明显下降趋势，位置在1.0×10⁸个/L附近，质量浓度0.6 mg/L时基本保持稳定，在质量浓度0.8 mg/L时有较明显的下降；DETA-Fe组水华鱼腥藻藻峰值在9.0×10⁷个/L附近波动，变化不大，水华鱼腥藻对铁的适应范围较大，整个实验浓度范围内，都保持着较高水平，在铁质量浓度为0.6 mg/L时达到最大值，约为9.8×10⁷个/L；草酸铁组随着质量浓度的增大，藻峰值变化规律不明显，具体表现为先减小后增大，然后减小再增大，出现两个较大的值，质量浓度为0.6 mg/L时达到最大值，约为8.0×10⁷个/L。腐殖酸铁组水华鱼腥藻藻峰值变化规律不明显，在质量浓度从0.2 mg/L到0.4 mg/L无明显增幅，质量浓度为0.6 mg/L和0.8 mg/L时有所下降，之后再增加，峰值最大点出现在质量浓度0.4 mg/L组，约为9.5×10⁷个/L。

不同初始质量浓度下不同络合态铁对水华鱼腥藻平均增长速率影响亦见图7~图10。由图可知，水华鱼腥藻平均增长速率与峰值曲线变化基本一致，只是波动幅度略有差别；柠檬酸铁铵组在实验浓度范围内，质量浓度0.2 mg/L时达到最大值，约为0.173 d^–1，其他浓度组别平均增长速率保持在0.14 d^-1左右；EDTA-Fe组平均增长速率随铁浓度变化不明显，增长速率在0.17 d^–1上下波动；草酸铁组变化趋势与藻峰值完全一致，质量浓度为0.2 mg/L时，藻平均增长速率最大，为0.155 d^–1。腐殖酸铁组随铁浓度增加，藻平均增长速率下降，最大平均增长速率出现在质量浓度为0.2 mg/L时，约为0.148 d^–1。

综上所述，水华鱼腥藻对铁浓度适应区间较大，整个实验浓度内，藻峰值和平均增长速率都保持在较高水平。不同络合态铁，水华鱼腥藻的最适宜生长浓度有所差异。柠檬酸铁铵最适生长铁质量浓度出现在0.2 mg/L附近，EDTA-Fe、草酸铁最适生长铁质量浓度出现在0.6 mg/L附近，腐殖酸铁的最适宜生长质量浓度出现在0.4 mg/L附近。

分析其原因，络合态铁对水华鱼腥藻的生长机理可能为：在氮磷营养盐充足的情况下，少量的铁元素能改善和增强藻细胞光合器官的结构、功能和活性促进藻细胞代谢和对营养物质的吸收，从而促进藻类的生长。所以水华鱼腥藻的生长速率处于较高水平。而当铁元素的量增加到一定量或更大量时，铁就会竞争性结合活性中心，取得活性中心Ca²⁺，竞争Mg²⁺并取代Mg²⁺等多种方式抑制腺苷酸环化酶、RNA合成酶、胶原酶、谷氨酸合成酶等的活性，从而抑制藻的生长。该机理与微量金属离子对藻类产生影响的机理基本一致：高浓度金属离子的存在，打破了生物最佳的营养元素生物可利用性的平衡，比例失调，导致藻类增殖受到抑制。然而，水华鱼腥藻在不同络合态铁组别中的最适生长浓度不同，是因为不同络合态铁组在其相应的最适宜浓度时，才能达到水华鱼腥藻的最适宜生长铁量。这与上文分析的原因吻合，不同络合态铁解络合的难易程度，决定了藻对铁离子的吸收情况。如柠檬酸铁铵，其中的铁较易被藻细胞吸收，因而较低的质量浓度(0.2 mg/L)时就能达到藻最适宜生长铁量，当浓度升高时，铁量过多，反而抑制了鱼腥藻的生长；又如EDTA-Fe组，其解络合较难，低浓度时，藻体难以获得足够的铁量，因而最适宜浓度会出现在较大质量浓度(0.6 mg/L)时。

3 结论

不同络合态铁对水华鱼腥藻增殖趋势的影响不同，主要取决于络合剂的稳定性以及耦合铁量。在相同络合态铁浓度下，柠檬酸铁铵与腐殖酸铁较之EDTA-Fe与草酸铁，生物可利用性更强，藻类表现出更快的促进时效及更大平均增长速率，但促进效果因络合态铁的浓度不同而略有差异；柠檬酸铁铵最适生长铁质量浓度出现在0.2 mg/L附近，EDTA-Fe、草酸铁最适生长铁质量浓度出现在0.6 mg/L附近，腐殖酸铁的最适宜生长质量浓度出现在0.4 mg/L附近。