天然多羟基酚类化合物如鞣花酸(Ellagic Acid, EA)、鞣酸(单宁酸)、没食子酸等，广泛分布于植物组织，如桉树叶。其中，鞣花酸(C₁₄H₆O₈)是没食子酸的二聚衍生物，作为植物酚类化合物在自然界中普遍存在。近年来，由于南方桉树广泛种植，天然多羟基酚类化合物容易与铁离子发生络合反应，导致林区水库水变黑，引起了广泛关注^[1]。在我国南方桉树林人工种植地区，水库水源地人口密集，中小型水库承担了农村生活饮用水源的功能。例如，广西南宁市有50座生活饮用水水源地水库，其中45座附近都种植了桉树^[2]。这种大规模和高比例的桉树种植导致水库水体泛黑频率高、影响范围广，严重威胁了当地水生物种的生存^[1-4]。然而，对于以桉树人工林区水库作为用作饮用水水源的附近居民是否存在安全风险尚且未知。

研究发现天然多羟基酚类化合物如鞣花酸及其合成物质在一定浓度范围内具有细胞毒性，并在不同细胞模型中表现出不同的生理效应。例如，在HepG2人肝癌细胞中，鞣花酸诱导Ca²⁺浓度依赖性升高，但在HA22T、HA59T人肝癌细胞或AML12小鼠肝细胞中未观察到类似现象^[5]。Owczarek等^[6]研究了鞣花酸对人类白血病早幼粒细胞HL-60、淋巴母细胞NALM-6和黑素瘤细胞WM 115的细胞毒性，发现其IC50值范围为62.3~300.6 μmol/L。以氧化锌为原料合成的鞣花酸−层状氢氧化锌插层化合物(EAN)，对乳腺癌MCF-7细胞和HepG2癌细胞表现出细胞毒性和抗增殖活性^[7]。此外，Ceker等也报道了高浓度EA(100和200 μmol/L)具有细胞毒性和致突变作用^[8]。

目前，有关水库泛黑现象和致黑物的相关研究已取得一定进展。研究发现桉树的茎和叶可在水体中浸出大量单宁酸，可能的泛黑机理是在硫化物、单宁酸、铁、锰同时存在的条件下，发生铁、锰与硫化物，硫化物与单宁酸，铁、锰与单宁酸等一系列反应，最终生成黑色络合物，导致水库泛黑^[4]。环境中检出的鞣花酸水平为：中药水龙骨中为62.18 μg/g^[9]，中药化香虫茶中为1.14~3.10 mg/g^[10]。根据前期研究，已知鞣花酸及其合成物在一定浓度范围内具有细胞毒性^[5-8]，但在天然饮用水体中，关于鞣花酸与重金属络合的生态环境风险及其毒性的研究非常有限。鉴于鞣花酸和三价铁混合形成的典型天然致黑物质可能对以水库水为饮用水源的居民人体健康构成潜在威胁，因此选择鞣花酸和三价铁作为本文的研究对象。

生物测试被广泛用于评价水中化学物质对生物的毒性效应，有助于弥补化学分析在未知物质和混合效应方面的局限性，是水质毒性评估的重要工具^[11]。在复杂的实际环境中，体外生物毒性测试能敏感、准确地定量环境混合物的整体生物效应^[12]。本文选取结直肠腺癌上皮细胞(DLD1)、肝细胞(LO2)和人肾上皮细胞(293T) 3种人源细胞为受试对象，采用以下几种细胞毒性评价指标：首先是细胞活力，细胞活力的降低是细胞受到毒害时重要而通用的指标之一^[13]。其次是活性氧(ROS)，作为一类高度活性的分子，在细胞内积累时可引发氧化应激反应，这是细胞应对外部压力和损伤的常见生理反应。过多的ROS积累会导致细胞受损^[14]，因此可通过测量ROS水平评估细胞的健康状态。最后，为了评估细胞结构是否受损，通常会检测细胞形态和细胞骨架蛋白F-actin的表达。F-actin在维持细胞形状、细胞运动和细胞分裂等生物学过程中发挥关键作用，因此可通过评估F-actin的表达了解化学物质对细胞的影响^[15]。

本研究通过综合分析3种指标，并与阴性对照进行比较，进行了多次独立重复实验，以判断暴露物的毒性情况。研究对象为不同浓度的鞣花酸(EA)和三价铁(Fe³⁺)，旨在探究它们的联合暴露毒性，并评估暴露于EA和/或Fe³⁺对DLD1、LO2和293T细胞的一般细胞毒性、细胞内ROS水平和细胞形态变化等影响，以明确其毒性效应特征。

结直肠腺癌上皮细胞(DLD1)、肝细胞(LO2)、人肾上皮细胞(293T)购自国家实验细胞资源共享平台。鞣花酸(纯度98%)购买自Macklin公司，三价铁盐为三氯化铁(纯度 > 99%)购买自阿拉丁。细胞培养过程中使用的RPMI和DMEM培养基购买自美国Thermofisher公司，胎牛血清，双抗(青霉素−链霉素)和0.05%胰蛋白酶(不含EDTA)购买自美国Hyclone公司。

(1) 细胞种类的选择依据：本文选用结直肠腺癌上皮细胞、肝细胞和肾上皮细胞作为研究对象，代表不同的靶组织和靶器官。这3种细胞系广泛用于毒性风险评价，比较它们对天然致黑物质的毒性反应是否存在差异，为更全面地评估天然致黑物质的潜在毒性和对人体的潜在健康风险提供了综合信息。

(2) 细胞密度的选择依据：初始细胞密度直接影响细胞的生长和繁殖速率。密度过低无法保持细胞在对数生长阶段，即细胞生长最为活跃和稳定的阶段；而密度过高则导致养分和生长空间竞争，影响细胞状态和实验结果。因此，选择适当的初始密度，如4×10³个细胞/孔，可确保实验的稳定性和可重复性，这是根据预实验确定的最优生长密度。

DLD1细胞以RPMI 1640完全培养基(10% FBS，1%双抗)培养，LO2和293T细胞则采用DMEM完全培养基(10% FBS，1%双抗)。培养条件为37℃，5% CO₂和95%相对湿度。细胞生长至汇合度达到85%以上时，进行消化接种。将对数期生长的3种细胞以4×10³个细胞/孔的密度均匀接种在96孔板中，每孔100 μL培养基，培养24 h。以0.1% DMSO的培养基为对照组，分别选择0.1、1、10 mg/L的EA单独暴露24 h以及与1 μmol/L Fe³⁺共同暴露24 h作为实验组。EA的浓度参考桉树林区水库水体的常见范围^[14]，Fe³⁺的浓度设计在EA与铁盐发生络合反应变色的临界点附近。每组设置3个平行实验，多次实验结果的RSD均保持在<30%。

细胞活力检测采用CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8，碧云天，中国)。在暴露结束后的孔板中加入10 μL/孔的CCK-8溶液，孵育1~1.5 h，随后使用酶标仪(Spark, Tecan)在450 nm 波长下测量吸光度。细胞活力的计算公式为^[16]

以DMSO作为对照组，即DMSO组的细胞活力是100%。通过比较实验孔和对照孔的信号，同时通过空白孔校正背景信号，得到实验组的相对细胞活力。

细胞内活性氧(ROS)检测采用活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit，碧云天，中国)。使用荧光探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)，该荧光素可被细胞内ROS从无荧光的DCFH氧化生成荧光产物2,7-二氯荧光素(DCF)。由于DLD1和293T细胞的贴壁性较差，为实现清晰的荧光成像，本实验预先使用0.01 mg/mL的多聚-L-赖氨酸包被96孔板，提高细胞贴壁性。

暴露24 h后，去除细胞培养液，向96孔板中加入PBS稀释的DCFH-DA(10 μmol/L)和Hoechst33342(5 μg/mL)混合染料，37℃孵育30 min。随后用 PBS 轻轻冲洗细胞2次，去除未进入细胞内的荧光探针。通过Operetta^TM高内涵成像分析系统(PerkinElmer，美国)原位检测化合物刺激后的荧光强度变化(DCFH-DA: E_x/E_m=488 nm/525 nm; Hoechst 33342: E_x/E_m=350 nm/461 nm，E_x为激发波长，E_m为发射波长)。最后，使用图像分析软件Harmony 4.9统计并分析DCFH-DA对应绿色荧光强度代表ROS水平。

培养和暴露过程的实验方法与细胞内ROS水平检测一致。暴露24 h后，取出96孔板，去除细胞培养液并用PBS清洗一次。使用4%多聚甲醛进行固定，同时用含有0.1% TritonX-100和1% 牛血清白蛋白的 PBS 通透细胞。采用5 μg/mL Hoechst33342和150 nM鬼笔环肽在室温下染色30 min，分别标记细胞核和细胞骨架。使用高内涵成像系统进行荧光图像采集(Hoechst 33342: E_x/E_m=350 nm/461 nm；鬼笔环肽: E_x/E_m=495 nm/515 nm)。最后，使用Harmony 4.9统计并分析鬼笔环肽对应绿色荧光强度代表F-actin表达水平。

所有实验均进行了3次独立重复，采用 SPSS 16.0进行单因素方差分析检验显著性差异，结果以均数±标准差($\overline x $ ± SD)，显著性水平设定为p < 0.05。

图1和图2展示了EA和/或Fe³⁺暴露对DLD1、LO2和293T 3种细胞活力的影响。当EA单独暴露时，与对照组相比，DLD1细胞活力仅在0.1 mg/L EA处理时下降11.0%，较高浓度组(1 mg/L和10 mg/L)无显著变化；对于LO2细胞，EA单独暴露表现出明显细胞毒性，且呈现一定剂量−效应关系，0.1、1 和 10 mg/L的EA处理分别下降了13.5%、12.8%和28.2% 的细胞活力；对于293T细胞，较低质量浓度的EA(0.1 mg/L)作用下细胞存活率为90.3%，呈现出轻微生长抑制，但高质量浓度(10 mg/L)暴露则显著促进了293T细胞增殖(上调约12.5%)。在1 μmol/L Fe³⁺单独作用时仅DLD1细胞活力受到抑制，下降13.9%，但Fe³⁺显著促进了293T和LO2细胞生长，分别增加了22.0%和15.6%。

图 1(Figure 1)

图 1 鞣花酸单独暴露对DLD1 (a)、LO2 (b)、293T (c)细胞活力影响 Figure 1 Cell viability of EA alone to DLD1 (a), LO2 (b), and 293T (c) 注：Ctrl表示二甲基亚砜暴露的对照组，*表示与DMSO阴性对照相比的显著差异程度(p<0.05: *; p<0.01: **; p<0.001: ***)

图 2(Figure 2)

图 2 鞣花酸和三价铁离子联合暴露对DLD1 (a)、LO2 (b)、293T (c) 细胞活力影响 Figure 2 Cell viability of EA in combination with Fe3+ on DLD1 (a), LO2 (b), and 293T (c) 注：Ctrl表示二甲基亚砜暴露的对照组，*表示与DMSO阴性对照比，#表示与单独暴露铁离子的对照比。有*或者#表示有显著差异(p<0.05: */#; p<0.01: **/##; p<0.001: ***/###)

联合暴露的结果显示，与阴性对照相比，LO2和293T的细胞活力均无明显影响；但和Fe³⁺单独暴露引起细胞增殖相比，两种细胞的增殖在联合暴露中被抑制。然而，对于DLD1细胞，联合暴露的毒性显著高于EA单独暴露，在1 mg/L和10 mg/L联合暴露时，细胞活力分别下降了17.8%、7.2%。与Fe³⁺单独暴露相比，Fe³⁺与低质量浓度0.1 mg/L和高质量浓度10 mg/L EA 共同暴露显著缓解了Fe³⁺单独暴露对DLD1细胞的生长抑制。

为进一步探究EA和/或 Fe³⁺对3种细胞的细胞毒性是否与ROS 和氧化应激有关，本文检测了3种细胞内的 ROS 水平。实验结果(如图3所示)表明，与对照组相比，EA和/或 Fe³⁺ 暴露均显著增加了3种细胞的ROS 水平。

图 3(Figure 3)

图 3 鞣花酸单独暴露和联合暴露对DLD1 (a)、LO2 (b)、293T (c)活性氧水平的影响 Figure 3 ROS production of EA alone and in combination with Fe3+on DLD1 (a), LO2 (b) and 293T (c) 注：Ctrl表示二甲基亚砜暴露的对照组，*表示与DMSO阴性对照比，#表示与单独暴露铁离子的对照比。有*或者#表示有显著差异 (p<0.05:*/#; p<0.01: **/##; p<0.001: ***/###)

1 μmol/L Fe³⁺单独暴露诱导ROS在DLD1、293T和LO2 细胞中分别上调了27.0%、31.4%、60.0%。而细胞活力实验中，1 μmol/L Fe³⁺单独作用仅抑制了DLD1的细胞活力，暗示其细胞毒性可能是氧化损伤引起的。在EA单独暴露时，0.1 mg/L和10 mg/L EA作用下DLD1细胞的ROS分别上调了20.7%、30.3%，但1 mg/L EA 无显著影响；而共同暴露时ROS上调更为剧烈，这也与细胞活力实验结果相吻合，联合暴露对DLD1细胞的氧化损伤和细胞毒性都更强烈。

对于LO2细胞，EA和/或Fe³⁺的暴露与 EA 的浓度均呈一定剂量−效应关系。单独暴露中ROS分别增加了19.3%、27.8%、28.3%，而共同暴露时则对应上调了29.3%、37.1%、43.6%。DLD1和LO2的ROS结果可能提示EA和Fe³⁺ 共同暴露比EA单独暴露时对细胞内ROS的影响更大。

对于293T细胞，0.1 mg/L和10 mg/L的EA处理显著增加了293T细胞的ROS(上调约36.6%和53.4%)，这一结果与DLD1单独暴露EA时的ROS结果相类似。共同作用时，0.1，1 mg/L的EA处理组中ROS水平比起单独暴露时略有增加。

从图4可见，3种人源细胞的微丝形状为长条纺锤状细丝，遍布整个细胞，细胞核为椭圆形。与对照组相比，细胞形态没有发现显著变化。无明显的细胞形态变圆或皱缩，细胞形态正常。

图 4(Figure 4)

图 4 鞣花酸单独暴露和联合暴露对DLD1 (a)、LO2 (b)、293T (c)细胞的形态影响 Figure 4 Cell morphology of EA alone and in combination with Fe3+ on DLD1 (a), LO2 (b), and 293T (c) 注：比例尺为100 μm

为进一步观察组成细胞骨架的丝状蛋白表达，本文统计了F-肌动蛋白的荧光强度变化(如图5所示)。结果发现在EA单独处理时，DLD1中F-actin急剧增加，在0.1，1 mg/L的EA处理下，分别增加了97.0%和76.1%，但其他两种细胞的F-actin表达不受EA单独处理的影响。1 μmol/L Fe³⁺单独暴露显著抑制了LO2的F-actin表达，下降了40.28%，但对其他两种细胞没有显著影响。

图 5(Figure 5)

图 5 鞣花酸单独暴露和联合暴露对DLD1 (a), LO2 (b)和293T (c) F-肌动蛋白的影响 Figure 5 F-actin expression of EA alone and in combination with Fe3+ on DLD1 (a), LO2 (b) and 293T (c) 注：Ctrl表示二甲基亚砜暴露的对照组，*表示与DMSO阴性对照比，#表示与单独暴露铁离子的对照比。有*或者#表示有显著差异 (p<0.05: */#;p<0.01: **/##;p<0.001: ***/###)

联合暴露组中，与对照组相比，0.1 mg/L的EA和Fe³⁺共同作用时，F-actin的表达在DLD1细胞中略有增加(15.9%)，逆转了原本在EA单独处理时大幅上调的趋势。相反，在1，10 mg/L的EA和Fe³⁺共同作用时，LO2细胞中的F-actin被抑制，且抑制程度随EA质量浓度的增加而加剧，分别抑制了24.3%和36.4%。共同暴露能一定程度缓解Fe³⁺ 单独作用对F-actin的抑制，但293T细胞在所有处理组中均未发现显著变化。

本文利用3种不同来源的人源细胞(肝、肾和肠道)综合评估了EA和Fe³⁺的联合暴露毒性，结果提示单独暴露和联合暴露在大部分情况下均存在一定细胞毒性。EA单独暴露下，细胞毒性依次为：LO2 > DLD1 ≈ 293T；Fe³⁺ 单独暴露对DLD1具有细胞毒性，但能促进LO2和293T细胞生长；EA与Fe³⁺联合暴露时，细胞毒性依次为：DLD1 > LO2 ≈ 293T。对DLD1细胞而言，联合暴露的毒性比单独暴露EA更强烈，通过和Fe³⁺单独处理的结果相比，本文认为对DLD1的联合毒性主要来自Fe³⁺。Fe³⁺在细胞中扮演重要的调节作用，如果浓度过高，会抑制细胞的生长和增殖。Poljak-Blazi和Li等分别发现0.1, 1 mmol/L Fe³⁺会显著抑制HeLa人宫颈癌细胞SK-N-SH人神经元肿瘤细胞的细胞活力^[17-18]。LO2在EA单独暴露中存在明显细胞毒性，且与暴露浓度呈现一定剂量−效应关系。而293T的细胞活力在EA单独处理组中表现出低浓度抑制、高浓度促进。EA和Fe³⁺的联合暴露显著逆转了Fe³⁺单独暴露引起的LO2、293T细胞增殖，没有表现出对这两种细胞活力的影响。

ROS广泛指代氧来源的自由基和非自由基，包含了超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、臭氧和单线态氧。由于它们含有不成对的电子，因而具有很高的化学反应活性。机体受到外源性和内源性刺激会频繁暴露于ROS中，少量ROS可作为信号转导分子，而过量的ROS会引起氧化应激毒性^[19]。一般来说，氧化应激是因为破坏性自由基的增加和/或抗氧化防御保护的减少。正常生理状态下，细胞会产生少量活性氧，但自由基的清除能力可维持ROS代谢平衡^[20]，不会诱发氧化损伤。当ROS浓度升高超过清除能力时，机体氧化还原平衡破坏，ROS会攻击细胞内的DNA、脂质和蛋白质，导致炎症和细胞凋亡等^[20-21]严重后果。本文实验结果显示EA和/或 Fe³⁺暴露均显著增加了ROS水平。Fe³⁺单独暴露下，ROS水平依次为：LO2 > 293T > DLD1；EA单独暴露和联合暴露中，ROS的升高在3种细胞中相差不大。但DLD1、LO2的ROS结果提示EA与 Fe³⁺共同暴露时，反应产物比EA单独暴露时可能对细胞内ROS的影响更大，显著上调了ROS水平。

最后，本文通过Hoechst 33342和鬼笔环肽分别对细胞核和细胞骨架进行染色，使用高内涵进行荧光图像采集，分析了暴露于EA和/或Fe³⁺对3种细胞形态变化的影响没有观察到明显变化。鬼笔环肽是一种环状七肽毒素，能与纤维状的肌动蛋白结合，并且荧光标记后仍能使微管保持稳定，清晰显示胞内微丝的形态和分布，是研究细胞内肌动蛋白微丝的有力工具^{[15, 22]}。进一步分析细胞骨架微丝蛋白F-actin在各处理组的变化，发现DLD1对较低浓度的EA暴露更为敏感，不仅增加了肌动蛋白的含量且下降了细胞活力。而293T对ROS的耐受力显然更强，增加的ROS并未影响F-actin蛋白的表达和细胞活力变化。LO2中过量的ROS，似乎是其F-actin减少以及细胞活力下降的原因。研究表明ROS的变化会导致细胞F-actin肌动蛋白异常，其ROS的适度上升会促进F-actin的合成，而高水平的ROS含量会引起F-actin的分解^[23-24]。

综上所述，3种人源细胞对EA和Fe³⁺的单独或联合暴露响应灵敏，初步提示EA与重金属联合暴露风险可能加剧。以细胞活力下降、活性氧增加和肌动蛋白紊乱为细胞毒性靶点，结合细胞形态观察，结果表明，EA和Fe³⁺的单独或联合暴露对人源细胞具有较强的毒害作用，按影响程度从大到小排序，依次为：肝细胞LO2 > 肠道细胞DLD1 > 肾细胞293T。上述研究仅对每一项检测结果进行单独分析，尽管这些结果通常存在相关性，由于桉树林水库的致黑性可溶解性有机物成分复杂，单宁酸类物质有鞣花酸、没食子酸等，仍缺乏对天然水体中致黑物单宁酸类和重金属物质具体风险量值的评估，因此需进一步结合化学分析进行综合毒性测试，全面评估桉树林区水库天然致黑污染物的毒性风险，为南方农村饮用水的水源地供水水质卫生健康的精准管控提供重要依据。