衰老是人类随着年龄增长的自然发展过程，包括人体皮肤、器官及其功能的衰老。皮肤衰老的主要表现为皮肤松弛、皱纹、暗淡。现代药理学研究认为，皮肤衰老的发生机制包括光老化、氧化损伤等，当皮肤受到外界有害因素(辐射、紫外线等)刺激时，皮肤组织内的活性氧自由基和活性氮自由基增多，细胞完整性受到破坏，蛋白质发生变性，从而引起机体氧化损伤，最终导致皮肤衰老。同时，大量研究也表明，药食同源中草药植物富含黄酮、多酚、多糖等多种具有抗氧化、抗菌、抗炎等功能的活性成分，对活性氧自由基具有良好的清除作用，因此被广泛地研究并应用于医药、功能食品、护肤品等领域^[1-5]。

五味子为木兰科植物五味子(Schisandra chinensis)的成熟干燥果实，主要产地为黑龙江、吉林和辽宁^[6]。研究表明，五味子中含有挥发油、有机酸、维生素、木脂素、三萜及多糖等多种化学成分^[7]，这些有效成分可以通过清除自由基发挥抗氧化作用^[8-9]。现有的研究大都利用细胞模型和动物模型对抗氧化活性进行评价验证，但《欧洲化妆品法规》从2009年3月起禁止在化妆品原料基因毒性评估中使用动物实验。因此，本文利用3D皮肤模型替代动物模型，评价五味子油对H₂O₂诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤的保护作用，分析其修复3D皮肤损伤的作用机制，为五味子油在抗衰老化妆品等方面的应用提供数据支持。

1 仪器与试剂耗材 1.1 主要仪器

岛津TQ8040型气相色谱−质谱联用仪(日本岛津公司)；全波长酶标仪Multiskan GO (赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；DK-S22电热恒温水浴锅(上海精宏仪器设备有限公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；FA1004电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.2 主要原料、试剂及耗材

五味子购自广州市康伦生物技术有限公司。磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline, PBS)、NaCl、无水 NaSO₄、K₂SO₄、二甲基亚砜(Methyl Sulfoxide, DMSO)、K₂S₂O₈、苏木精染液、伊红染液、无水乙醇均购自天津大茂化学试剂厂。2,2-2苯基-1-苦基肼(2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl，DPPH)粉末(纯度>97%)购自上海源叶生物科技公司。2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 )二胺盐(2,2-Azinobis(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid) Ammonium Salt，ABTS)粉末购自美国Sigma公司。DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2-H-Tetrazolium Bromide，MTT)溶液购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BCA蛋白检测试剂盒(BCA Protein Assay Kit)购自碧云天生物技术有限公司。所有试剂为分析纯。人永生化表皮角质形成细胞(Human Immortalized Epidermal Cells，HaCaT)购自上海中乔新舟生物科技有限公司；Episkin皮肤模型购自上海斯安肤诺生物科技有限公司。

2 试验方法 2.1 五味子油的制备

称取五味子碎粉100 g，过40目筛，加入6倍量质量分数为6%的 NaCl 溶液，浸泡0.5 h，采用水蒸气蒸馏装置加热微沸3 h，收集玻璃分水器中的上层精油，并用无水 NaSO₄ 干燥，过滤，得到五味子油。装瓶密封处理后保存于4 °C的环境中^[10-12]。

2.2 五味子油主要化学成分测定

1) 色谱条件

色谱柱为HP-5 石英毛细管色谱柱(50 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度为60 ℃；升温程序以 60 ℃为起始温度，以20 ℃/min升至300 ℃，保持3 min；载气(He)流速为1 mL/min，压力为57.4 kPa，进样量为0.5 μL；分流比为1:20^[13-14]。

2) 质谱条件

电子轰击(EI)离子源的电子能量为70 eV，传输线温度为260 ℃；离子源温度为230 ℃；激活电压为1.5 V；质量扫描范围为50~650 m/z^{[13, 15]}。

按上述条件对五味子油进行成分分析，然后利用计算机进行数据处理和数据库自动检索，结合相关文件鉴定五味子油的各个化学成分，采用峰面积归一化法进行定量分析，分别求得各化学成分的相对质量分数。

2.3 DPPH法测定五味子油的抗氧化能力

依次加入 100 μL 0.1 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液和 100 μL不同质量浓度的样品溶液于 96 孔板中，混匀，室温避光反应 30 min，然后在波长 517 nm 处测定吸光度A；将 100 μL 不同质量浓度的样品溶液与 100 μL 无水乙醇混合，测得吸光值A₀；以蒸馏水代替样品作为空白对照，与 100 μL 0.1 mmol/L DPPH-无水乙醇溶液混合，测得吸光值 A₁，通过式(1)计算DPPH自由基清除率I。

$ I=\left(1-\frac{{A}-{A}_{0}}{{A}_{1}}\right)\times 100\% $

(1)

2.4 ABTS法测定五味子油的抗氧化能力

将 100 μL ABTS 溶液和 100 μL氧化剂溶液混匀，配置成 ABTS 工作母液，避光静置过夜，形成 ABTS自由基储备液。使用前用 0.1 mol/L PBS缓冲液(pH7.4)稀释 35 倍成为 ABTS 工作液，使其在 730 nm处吸光度为(0.7±0.02)，并在 30 ℃平衡。依次加入100 μL ABTS 自由基溶液和100 μL不同质量浓度的样品溶液于 96 孔板中，混匀，同时设置对照组和空白组，室温避光反应 5 min 后，测定其在 734 nm 处的吸光度值，分别记为E_X、E₁和 E₀，通过式(2)计算ABTS自由基清除率K。

$ K=\left(1-\frac{{E}_{\mathrm{X}}-{E}_{0}}{{E}_{1}}\right)\times 100\% $

(2)

2.5 五味子油对H₂O₂诱导HaCaT细胞氧化应激损伤的保护作用测试

1) HaCaT细胞培养

将HaCaT细胞培养于含10%体积分数的胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5%体积分数CO₂细胞培养箱中常规传代，每天换液，取对数生长期细胞进行后续实验。

2) 五味子油对HaCaT细胞增殖的影响

HaCaT细胞培养至90%满后，配制成密度为5×10⁴ 个/mL细胞悬液。按100 μL/孔的密度接种于96孔培养板，培养24 h后，用枪吸去培养基。加入100 μL完全培养基作为空白组，分别加入100 μL含0.04，0.20，1.00 mg/mL五味子油的完全培养基作为药物组，与HaCaT细胞孵育12 h，每组4个复孔。采用MTT法检测各测试孔在570 nm处的吸光度，计算HaCaT细胞存活率。

3) 五味子油对H₂O₂诱导HaCaT细胞氧化应激损伤的保护作用测试

实验设置调零孔、空白组、模型组及加入五味子油的药物组。空白组及模型组加入完全培养基100 μL，药物组分别加入含0.04，0.20，1.00 mg/mL五味子油的完全培养基100 μL，孵育12 h后，除空白组外，其余各组加入100 μL 的H₂O₂溶液，每组4个复孔，孵育4 h。MTT法检测各测试孔在570 nm处的吸光度，计算HaCaT细胞存活率。

2.6 五味子油对H₂O₂诱导3D皮肤模型氧化应激损伤的保护作用测试

1) 五味子油对H₂O₂诱导3D皮肤模型中细胞增殖的影响

使用Episkin表皮模型作为3D皮肤模型进行实验。实验分为空白组、模型组和药物处理组。空白组的皮肤模型不做任何处理；模型组每个孔加入100 μL的500 μM的H₂O₂处理2 h后，加培养基继续作用48 h；药物处理组加入H₂O₂处理2 h后，加入五味子油作用48 h。

利用MTT法判断各组细胞增殖情况；利用H&E染色法观察并测定各组表皮层厚度的变化。

2) 五味子油对H₂O₂诱导3D皮肤模型中SOD、CAT酶活力和IL-6水平的影响

取空白对照组、H₂O₂损伤模型组、药物处理组的表皮组织，按照SOD、CAT酶活力和IL-6检测试剂盒说明书进行操作。

2.7 统计学方法

运用Microsoft Execl 2019处理数据、GraphPad Prism 9进行统计分析，结果以均数±标准差( $ \bar{X}\pm s $ )表示，各组间差异分析比较采用One-way ANOVA方差分析，两两比较采用t检验。

3 实验结果 3.1 五味子油主要化学成分分析

本实验对五味子油中主要化学成分进行含量测定。结果如表1所示，在五味子油中共检测出37种化合物。其中，依兰烯的相对质量分数最高，为26.80%，与赵秀英等^[13]对五味子油的研究结果一致。β-喜马烯的相对质量分数为12.93%，是五味子油中相对质量分数较高的物质。乙酸龙脑酯的相对质量分数为2.01%，李晓花等^[16]研究发现其具有多种药理活性，尤其是在保胎、抗炎和止痛方面，效果较好。在本研究中，五味子油中的主要化学成分(如依兰烯、蒎烯等)与文献[13-15]报道的基本一致。

以成分类别分析，五味子油含有11种倍半萜类化合物，占总质量的74.09%；12种单萜类化合物，占总质量的9.33%；此外五味子油中还含有少量的醇、酯、醛、酮以及苯的衍生物等。由此可知五味子种子挥发油的化学成分主要属于倍半萜类和单萜类化合物，与赵秀英等^[13]的报道一致。萜类及其衍生物广泛应用于制药产业，α-蒎烯、β-蒎烯已被证明可作为针对相同或不同肿瘤细胞系的良好抗增殖剂^[17]，同时α-蒎烯也是一种具有消炎作用的重要单萜，其抗炎作用能够加快伤口愈合；榄香烯具有镇痉、抗病毒、平喘、抗菌等活性。

结果反映，利用水蒸气蒸馏法可以有效提取五味子中的挥发油成分，对五味子油进行开发和利用是可行且有意义的。

3.2 五味子油清除DPPH、ABTS自由基能力的分析

结果如表2所示，随着五味子油质量浓度的增加，DPPH自由基清除率与质量浓度呈现量效关系，当其浓度达到10 mg/mL时，DPPH自由基的清除率可达(60.87±0.72)%。通过计算可得，DPPH自由基剩余一半时所需抗氧化剂的质量浓度 (IC₅₀)约为5.6 mg/mL。

通过分析表3可以看出，五味子油对ABTS自由基同样具有着良好的清除作用。随着五味子油质量浓度的增加，ABTS自由基清除率与质量浓度呈现量效关系。在五味子浓度达到10 mg/mL时，ABTS自由基的清除率可达(52.14±0.89)%。通过计算可得，ABTS自由基剩余一半时所需抗氧化剂的质量浓度(IC₅₀)约为 9.4 mg/mL。

3.3 五味子油对H₂O₂诱导细胞损伤的保护作用

1) 五味子油对HaCaT细胞增殖效果的影响

如表4所示，HaCaT细胞在经过五味子油处理了24 h后，0.04~1 mg/mL浓度下，五味子油对HaCaT细胞没有明显的细胞毒作用(P<0.005)。故在后续方案中，使用0.04，0.2，1 mg/mL的五味子油进行实验。

2) 五味子油对H₂O₂诱导HaCaT细胞损伤的保护作用分析

如表4所示，与空白组相比，模型组及药物组采用H₂O₂对细胞造成氧化损伤，细胞存活率显著降低，降低了约50%；而在加入五味子油处理后，不同质量浓度的实验组细胞存活率均高于模型组。这说明，在0.04~1 mg/mL的浓度范围内，五味子油对H₂O₂诱导的HaCaT细胞损伤具有一定的保护作用(P<0.000 1)，此结论与Lee等^[18]研究结果相符合。

3.4 五味子油对H₂O₂诱导3D皮肤模型氧化应激损伤的保护作用分析

1)五味子油对H₂O₂诱导3D皮肤模型中细胞增殖、皮肤厚度改变的影响

细胞增殖结果见表5，结果反映模型组H₂O₂对皮肤表皮细胞有较强的损伤作用，经过H₂O₂处理后的细胞存活率与空白对照组相比，细胞存活率下降约45%，并且差异具有显著性(P<0.000 1)；在加入五味子油后，细胞的存活率显著增高，与模型组相比提高约27%。3D皮肤模型的MTT检测结果表明皮肤在经过五味子油作用后，能够增强其抗氧化活性。

通过表5及图1可以看出，相比于空白组的表皮层厚度，经过H₂O₂处理的皮肤表皮层厚度降低了近50%，说明H₂O₂对皮肤的表皮层造成了损伤。经过五味子油处理过后，表皮层厚度与模型组相比有显著的增加，达到了(39.78±1.96)μm，提升了约64%。说明五味子油对H₂O₂引起的皮肤表皮层氧化损伤有一定的缓解作用。

2)五味子油对H₂O₂诱导3D皮肤模型中SOD、CAT酶活力、IL-6水平的影响

检测结果见表6。SOD酶活力检测结果显示H₂O₂单独作用下的模型组使SOD酶活力降低了约60%；而通过五味子油作用后，SOD酶活力相较于模型组提高了149 %，这与Yang 等^[19]研究结果相近。结果说明，五味子油不仅可以缓解H₂O₂对SOD酶的伤害，也能在一定程度上促进SOD酶的表达，以此来降低H₂O₂对皮肤的氧化损伤。

CAT酶活力结果显示，药物组的酶活力相较于空白组，提高43%(P<0.05)；与模型组相比，酶活力提高103%(P <0.001)。结果证明五味子油能够促进CAT酶的表达，与An等 ^[20]研究结果一致 ，从而有效减轻H₂O₂对皮肤的氧化损伤。

IL-6质量浓度检测结果显示，模型组IL-6质量浓度与空白组相比，升高了约31% (P<0.001)；药物组的IL-6质量浓度相较于模型组，其表达水平显著降低约32%(P<0.001)。结果说明，五味子油能够降低IL-6的表达，这与Dong等^[21]研究结果一致，从而减轻H₂O₂对皮肤的氧化损伤。

4 结论

衰老是生命过程中的一种自然现象，皮肤老化是人体衰老的重要标志。H₂O₂是一种常用的细胞氧化应激诱导剂，可诱导细胞产生自由基，加速细胞老化，进而促使细胞凋亡^[22]。而目前的研究大都利用动物实验来评价生药提取成分的抗氧化性能，本文为响应2009年颁布的《欧洲化妆品法规》的要求，利用3D皮肤模型替代动物进行实验，以MTT法评价五味子油对H₂O₂诱导的HaCaT细胞应激损伤2D、3D模型的保护作用，并以DPPH自由基和ABTS自由基清除效率为考察指标，全方面评价五味油的抗氧化保护作用。

通过体外自由基实验，结合H₂O₂诱导HaCaT细胞2D、3D皮肤模型，可得出以下结论：(1) 五味子油能够直接清除自由基，并且清除DPPH、ABTS自由基的IC₅₀分别为5.6 mg/mL和9.4 mg/mL，并以此降低皮肤因自由基造成的氧化损伤。(2) 五味子油能够增加表皮层厚度，更有效地保护皮肤免受外界刺激损伤；促进SOD酶和CAT酶的表达，有效修复因H₂O₂造成的细胞损伤；并降低IL-6的质量浓度，提高细胞存活率。

综上所述，本文证实了五味子油可增加细胞的抗氧化能力，减少细胞凋亡，减轻炎症反应，从而令皮肤具有较强的抗氧化能力和消炎能力。这为五味子油抗氧化产品的研发提供了一定的理论基础和数据支持。因此，对五味子油进行深入研究，使其成为一种减少皮肤氧化损伤的天然保护剂具有发展前景。