银耳(Tremella fuciformis)属于真菌门，担子菌纲，异隔担子菌亚纲。银耳目，银耳科，银耳属^[1]。银耳有很多的别名，如雪耳、白木耳等。银耳是一种常见的食用菌，在福建、四川、贵州、浙江、湖北等地广泛种植。银耳多糖具有广泛的生物学活性和功能，包括抗衰老^[2]、抗氧化^[3-5]、抗肿瘤^[6]、抗炎^[7-8]和降低血糖^[9]等。传统的银耳多糖提取工艺有酶提取法、酸提取法、碱提取法和热水浸提法等^[10-15]。超声波辅助提取工艺是近年来较为常用的一种多糖提取方法，具有省时高效、节能环保的优点^[16-17]。本文采用热水浸提法，辅以超声波提取工艺提取银耳多糖，通过对超声波功率、提取料液比、提取温度和提取时间进行单因素试验，并通过正交试验，确定最佳提取工艺。本研究还建立了脂多糖致小胶质细胞炎症模型，探讨银耳多糖的抗炎活性，为银耳多糖的进一步开发利用提供依据。

1 实验部分 1.1 主要试剂和仪器 1.1.1 主要试剂

银耳产自四川通江，购自佛山市爱伦生物技术有限公司。苯酚、浓硫酸、葡萄糖均为分析纯，购自阿拉丁化学试剂；无水乙醇、甲醇购自天津大茂化学试剂厂；脂多糖购自Sigma公司。DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基、磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline，PBS)、胎牛血清购自美国Gibco公司。BCA蛋白检测试剂盒（BCA Protein Assay Kit）购自碧云天生物技术有限公司；TRPV1Elisa试剂盒购自江苏酶标生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器

高速多功能粉碎机(武义海纳电器有限公司)、DK-S22电热恒温水浴锅(上海精宏仪器设备有限公司)、超声波发生仪(VS-100UE，无锡沃信仪器制造有限公司)、Z326K离心机(贺默(上海)仪器科技有限公司)、全波长酶标仪Multiskan GO(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。

1.2 银耳多糖超声波提取工艺优化 1.2.1 银耳多糖的提取

将银耳子实体干制品经粉碎过80目筛，得到银耳碎粉。称取30 g银耳碎粉，加入适量去离子水浸润30 min后，置于超声波提取设备中，按照设定条件进行超声波辅助提取、过滤，银耳提取液在5000 r/min离心10 min，取银耳多糖上清液，在60 ℃条件下减压浓缩至溶液体积的1/10，加入浓缩液体积4倍量的无水乙醇，重复1次，醇沉过夜。取多糖沉淀物冷冻干燥，即得银耳多糖。

1.2.2 银耳多糖提取率的测定

总糖含量的测定：参考文献方法，采用苯酚−硫酸法测定银耳多糖的总糖含量^[18-19]。取适量葡萄糖置于105 ℃烘箱烘干至恒重，取干燥好的葡萄糖标准品100 mg置100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的葡萄糖标准储备液。精密移取标准储备液1，2，4，6，8，10 mL置100 mL容量瓶，加蒸馏水定容，配制系列质量浓度为0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mg/mL的系列标准溶液。分别移取上述系列葡萄糖标准溶液1 mL置10 mL具塞玻璃试管中，依次加入0.5 mL苯酚溶液，浓硫酸2.5 mL，充分涡旋，冷却至室温，另取1 mL蒸馏水作为空白对照，将上述溶液于490 nm波长处测定溶液的吸光度值，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程： $ y=10.25x+ 0.013 $ ， $ {R}^{2}=0.999\;7 $ 。表明葡萄糖标准品在0.01~ 0.1 mg/mL内质量浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

提取率的测定：取银耳多糖提取液1 mL置10 mL具塞玻璃试管中，依次加入0.5 mL苯酚溶液，浓硫酸2.5 mL，充分涡旋，冷却至室温，于490 nm波长处测定溶液的吸光度值。将测得的吸光度值代入标准曲线方程，计算得到银耳多糖质量浓度。再将银耳多糖质量浓度代入式（1）计算，即得银耳多糖提取率

$ {{\text{提取率}}}({\text{%}})=(CV\times {{\text{稀释倍数}}}/M)\times 100{\text{%}}$

其中，C为测得吸光度对应的质量浓度，V为提取液的体积，M为银耳碎粉质量。

1.2.3 银耳多糖提取单因素试验

粉碎过筛后的银耳粉末，按照表1的设定条件进行多糖提取。

1.2.4 银耳多糖提取最佳工艺条件的确定

通过单因素试验所得工艺，以超声波频率，提取料液比和提取温度为试验因素设计三因素三水平的正交试验，确定超声波辅助热水浸提银耳多糖的最佳工艺条件，正交试验因素水平见表2。

1.3 银耳多糖对LPS诱导BV2细胞的TRPV1调控作用

细胞培养：将BV2小胶质细胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养，置于37 ℃的CO₂培养箱中。每日观察细胞形态，待BV2细胞融合达约80%时，进行传代培养。

药物干预：取对数生长期的BV2细胞，在倒置显微镜下观察，细胞生长至80%左右时，进行实验。在6孔板中接种BV2小胶质细胞(5×10⁴个细胞每孔)，实验分为3组：空白对照组、单独LPS(质量浓度为1 μg/mL)处理组和LPS+银耳多糖(质量浓度为62.5，250，1000 μg/mL)组。LPS组在不含血清的培养基中加入LPS，最终质量浓度为1 μg/mL；LPS+银耳多糖组先分别用加入银耳多糖(质量浓度为62.5，250，1000 μg/mL)的不含血清培养基处理2 h，随后加入LPS，最终质量浓度为1 μg/mL。培养24 h后，弃去上清液，收集细胞，进行细胞裂解，进一步进行蛋白测定。

细胞裂解：(1) 将收集到的细胞转移到15 mL离心管中，5000 r/min 离心5 min；(2) 弃去上清液，加入1 mL PBS重悬细胞，转移至1.5 mL EP管中，5000 r/min离心10 min；(3) 弃去上清液，每管加入150 μL细胞裂解液，吹打均匀，冰上反应10 min，离心(4 ℃，12000 r/min，5 min)，将离心后的上清液转移到1 mL的EP管中，使用BCA蛋白检测试剂盒进行蛋白定量，检测提取蛋白的浓度。

1.4 数据的统计与分析

采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，采取 t 检验，相关系数用R表示，p值< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论 2.1 单因素优化实验 2.1.1 超声波功率对银耳多糖提取率的影响

在料液比为1∶40 (g·mL^–1)、提取温度为60 ℃、提取35 min的条件下，测定超声波功率对银耳多糖提取率的影响，实验结果见图1。由图1可知，在一定范围内，银耳多糖的提取率随超声波功率升高而上升，可能是因为超声波能辅助破坏细胞壁，多糖溶出加快，当超声波功率达到350 W后，银耳多糖提取率增加幅度较低，银耳多糖接近溶出极限，因此选取350 W为较佳超声波功率。

2.1.2 提取料液比对银耳多糖提取率的影响

在超声波功率为350 W，提取温度为60 ℃，提取35 min的条件下，测定提取料液比(g/mL)对银耳多糖提取率的影响，实验结果如图2。由图2可知，在一定范围内，银耳多糖的提取率随提取料液比的较小而上升，当料液比为1∶40 (g·mL^–1)时，随着料液比增大，银耳多糖提取率增加较少，料液比对银耳多糖溶出影响不明显，因此选取1∶40为较佳提取料液比。

2.1.3 提取温度对银耳多糖提取率的影响

在超声波功率为350 W、提取料液比为1∶40 (g·mL^–1)、提取35 min的条件下，测定提取温度(℃)对银耳多糖提取率的影响，实验结果如图3。由图3可知，在一定范围内，随着温度的升高，银耳多糖提取率增加，这是因为温度升高促进了细胞裂解，加快了多糖溶出。当温度达到60 ℃时，温度升高对银耳多糖的提取率升高不明显，因此选取60 ℃为较佳提取温度。

2.1.4 提取时间对银耳多糖提取率的影响

超声波功率为350 W、提取温度为60 ℃、提取料液比为1∶40 (g·mL^–1)的条件下，测定提取时间(min)对银耳多糖提取率的影响。实验结果如图4所示，随着提取时间的增加，银耳多糖的提取率增加，当提取时间超过35 min时，提取时间的增加对多糖提取率的影响不明显，因此选取35 min为较佳提取时间。

2.2 超声波辅助热水浸提银耳多糖最佳工艺的确定

由表3可见，极差B>A>C，即提取条件对银耳多糖提取率的影响：超声波功率>料液比>温度。不同水平情况中，料液比K2>K3>K1，则最佳水平为A2；超声波功率K3>K2>K1，则最佳水平为B3；提取温度K3>K2>K1，则最佳水平为C3。最佳工艺是A2B3C3，即提取料液比为1∶40 (g·mL^–1)，超声波功率为450 W，提取温度为70 ℃，提取2次，提取时间为35 min。

由表4可知，B的F值最大，其次是A，再次是C，即对银耳多糖提取率的影响超声波功率>料液比>温度。方差分析得出的影响因素强弱与极差分析得出的结论相同，可双重验证实验分析结果。

2.3 银耳多糖对LPS诱导的BV2细胞作用后的TRPV1结果分析

通过不同质量浓度的银耳多糖干预LPS诱导的BV2细胞损伤，来探讨银耳多糖对神经炎症的影响。实验结果如图5所示，与LPS组相比，不同质量浓度的银耳多糖(62.5，250，1000 μg/mL)作用后，LPS+银耳多糖组的TRPV1 的表达量明显下降，且随着银耳多糖质量浓度的升高而降低。结果表明，银耳多糖对于LPS诱导的BV2细胞损伤具有预保护作用，而且具有浓度依赖性。

3 结论

通过对超声波辅助热水浸提银耳多糖的工艺条件进行优化，得到的较佳的工艺条件为：提取料液比为1∶40 (g·mL^–1)，超声波功率为450 W，提取温度为70 ℃，提取时间为35 min。研究结果表明，所得到的银耳多糖能够明显抑制LPS诱导的BV2细胞TRPV1的分泌，提示银耳多糖可能具有良好的抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症的作用，可能在防治与神经炎症相关的疾病，如阿尔茨海默病等方面具有一定的效果。本研究所使用的银耳多糖为粗提物，仍然含有一定的杂质，需要进行进一步的分离纯化及结构鉴定，明确其单糖组成及结构，再进行药理活性研究，明确确切的抗炎药效成分，以便进一步开发利用。