肺癌由于发病率高、致死率高, 已经成为人类最致命的癌症之一, 在癌症发病率中位居第二, 5年生存率不足15%, 其中非小细胞肺癌占肺癌总数的85%^[1].众所周知, 吸烟是罹患肺癌的首要原因, 但随着女性肺癌发病率的不断上升性别因素已成为学者们关注的另一个重要因素.有调查显示男性肺癌患者中吸烟人数占85%, 而女性只占47%, 提示肺癌的发生存在很大性别差异.研究表明雌激素与吸烟之间存在协同效应, 可增强吸烟诱导的肺癌发生^[2].同时, 雌激素还影响肺癌患者的预后^[3-4]：接受过雌激素替代治疗的肺癌患者死亡率高于未接受者, 绝经后女性肺癌死亡率低于老年男性.雌激素受体(ER)是雌激素发挥效应的关键物质, 因此体内雌激素受体水平直接与雌激素生理作用相关.肺癌患者肿瘤组织中雌激素受体表达明显高于肿瘤旁正常组织, 并且与肺癌发生关系密切.本研究旨在探讨雌激素与Notch通路在促进肺癌细胞增殖方面的关系.

NCI-H23(ATCC), DMEM培养基(Sigma, 美国), 小牛血清(FBS)(Sigma, 美国), 结晶紫(Sigma, 美国), 噻唑蓝(Sigma, 美国)、抗ERα、Bcl-2、Bax、PCNA、Notch1、Hes1一抗(cell signaling, 美国), 抗兔、羊二抗(Santa Cruz, 美国), E2(Sigma, 美国), DATP (Sigma, 美国), Notch1 siRNA (Santa Cruz, 美国).

NCI-H23用DMEM培养基+10% FBS置于37 ℃、CO₂ 5%、饱和湿度的培养箱中培养.

NCI-H23长至80%融合时用0.25%胰酶消化, 加入含血清DMEM培养基终止消化, 调整细胞密度至3×10⁴/mL, 以100 μL/孔接种于96孔板中, 培养24 h后吸去培养基, E2组加入含E2终浓度为10^-7 mol/L的DMEM完全培养基, E2+DAPT组加入含E2和DATP终浓度分别为10^-7mol/L、10^-5 mol/L的DMEM完全培养基, 对照组加DMEM完全培养基.每组设6个复孔, 24 h后加入MTT 15 μL/孔孵育4 h, 检测570 nm吸光度值.实验重复3次.

NCI-H23细胞长至80%融合时0.25%胰酶消化, 加入含血清DMEM培养基终止消化, 计数, 以500个/孔接种于6孔板中, 培养24 h后吸去培养基处理组加入含E2或E2+DAPT的DMEM完全培养基(E2、DAPT浓度同1.2.2), 对照组加DMEM完全培养基, 每组设2个复孔, 每3 d换液.培养7 d后, 吸去培养基, PBS洗1次, 加入浓度为0.5%的结晶紫溶液1.5 mL, 室温静置30 min, 蒸馏水洗去多余结晶紫溶液, 室温晾干.实验重复3次.

NCI-H23细胞长至80%融合时0.25%胰酶消化, 加入含血清DMEM培养基终止消化, 计数, 以3×10⁵个/孔接种于6孔板中培养6 h, 待细胞完全贴壁后换成无血清DMEM培养基培养18 h, 吸去培养基, 处理组加入含E2或E2+DAPT的DMEM完全培养基(E2、DAPT浓度同1.2.2), 对照组加DMEM完全培养基, 每组设2个复孔.24 h后去除培养基, PBS洗1次, 0.25%胰酶消化, 终止消化后1 200 r/min离心5 min, PBS洗1次, 加75%乙醇3 mL固定, -20 ℃保存.用前离心去除乙醇, 加PI染液1 mL, 流式细胞仪检测DNA含量.实验重复3次.

NCI-H23长至80%融合时0.25%胰酶消化, 调整密度至10×10⁴/mL, 以2 mL /孔接种于6孔板中置37 ℃、CO₂ 5%、饱和湿度的培养箱中培养24 h, 处理组转染Notch1 siRNA, 对照组转染control siRNA.转染24 h后吸去培养基, E2组加入含E2终浓度10^-7mol/L的DMEM完全培养基, 对照组加DMEM完全培养基.

转染液准备(单孔量)将4 μL siRNA滴入100 μL的siRNA转染培养基中制成溶液A; 将6 μL siRNA转染试剂滴入100 μL的siRNA转染培养基中制成溶液B.将溶液A加入到溶液B中制成转染混合液, 移液器上下轻轻混匀, 室温静置30 min.往装有转染混合液的EP管中加入0.8 mL转染培养基, 轻轻混匀.吸去6孔板中的培养基, 用转染培养基润洗细胞, 最后加入转染液.6 h后换液.再24 h后收集细胞提取总蛋白.实验重复3次.

NCI-H23长至80%融合后用0.25%胰酶消化, 计数并接种4.5×10⁵个细胞于6 cm培养皿中, 24 h后吸去培养基, 经过与1.2.2和1.2.5相同处理后收集细胞提取总蛋白.总蛋白提取方法如下：于冰上用细胞刮收集细胞后离心去除培养基, PBS洗1次, 离心去除PBS后加蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂和PSMF)200 μL, 移液器反复吹打并置于冰上60 min, 4 ℃ 10 000 rcf离心10 min, 收集上清-80 ℃保存备用.蛋白于用前定量并制备成上样样品.电泳、转膜、0.5%脱脂牛奶封闭, PBS洗膜5 min, 孵育ERα、Bcl-2、Bax、PCNA、Notch1、Hes1一抗4 ℃过夜, PBS洗膜3次, 每次10 min, 室温孵育二抗1 h, PBS洗膜3次, 每次10 min, ECL显影.实验重复3次.

应用SPSS17.0对数据计量资料进行t检验, 计数资料以均数±标准差表示, P＜0.05为差异有统计学意义.

如图 1~5所示, 10^-7 mol/L E2作用24 h后吸光度值高于对照组, 表示E2处理后细胞活性增强, 差异有统计学意义(P＜0.05);细胞集落分析结果显示用含E2 10^-7 mol/L的DMEM完全培养基培养7 d后NCI-H23增殖形成的集落较对照组数量多、面积大, 同等面积集落中E2处理组细胞多、着色深, 说明E2处理可使细胞增殖速度加快.PI流式细胞术结果提示E2使S期NCI-H23细胞比例增加明显, 为对照组(cont组)的1.33倍, G0-G1期细胞比例降低.Western blot结果显示10^-7 mol/L E2作用24 h后PCNA、Bcl-2表达增加, Bax表达减少, 提示细胞在E2作用下增殖能力和抗凋亡能力增强.

图 1(Figure 1)

图 1 E2对NCI-H23细胞增殖的影响(MTT) Figure 1 The effect of E2 on NCI-H23 proliferation (MTT)

图 2(Figure 2)

图 2 E2对NCI-H23细胞增殖的影响(克隆培养) Figure 2 The effect of E2 on NCI-H23 proliferation (clone assay)

图 3(Figure 3)

图 3 E2对NCI-H23细胞周期的影响 Figure 3 The effect of E2 on cell cycle of NCI-H23

图 4(Figure 4)

图 4 E2对蛋白表达的影响(Western blot) Figure 4 The effect of E2 on protein expression (Western blot)

图 5(Figure 5)

图 5 E2对蛋白表达的影响 Figure 5 The effect of E2 on protein expression

如图 6~10所示, DATP+E2共同作用组细胞活性较E2单独作用组明显降低且低于cont组, 两两相比差异均有统计学意义(P＜0.01), 提示DATP不仅可以逆转E2引起的细胞增殖, 可能对肿瘤细胞本身的增殖也具有抑制作用; 集落形成分析显示DATP+E2共同作用组集落形成减少, 细胞增殖速度减慢, 与cont组接近, 与E2组差异明显, 该结果与MTT结果一致; 流式细胞术结果显示与E2组相比DATP+E2联合作用的S期细胞比例下降, 仅为E2组增殖期细胞的66%, G0-G1期细胞比例增加, 同样说明DATP能够减慢E2引起的细胞快速增殖, 与cont组相比DATP+E2组S期细胞比例低于cont组, 说明DATP+E2组细胞增殖较cont组慢, 与MTT、集落分析结果吻合; Western blot结果显示DATP+E2共同处理的NCI-H23细胞与E2单独作用组相比增殖相关蛋白Bcl-2、PCNA表达明显降低, 细胞增殖能力减弱, 并且低于cont组.除上述结果外, 图 9、图 10还显示与cont组相比E2刺激使Notch1、Hes1表达升高, DATP+E2共同处理后的NCI-H23不仅Notch1、Hes1表达降低ERα表达也明显减少, 提示Notch1信号可能参与E2的促进细胞增殖作用, DATP+E2联合作用导致的细胞增殖速度减慢、增殖能力下降或许与DATP抑制ERα表达有关.

图 6(Figure 6)

图 6 DATP对E2诱导的NCI-H23细胞增殖的影响(MTT) Figure 6 The effect of DATP on NCI-H23 proliferation of E2-induced (MTT)

图 7(Figure 7)

图 7 DATP对E2诱导的NCI-H23细胞增殖的影响(克隆培养) Figure 7 The effect of DATP on NCI-H23 proliferation of E2-induced (clone assay)

图 8(Figure 8)

图 8 DATP对E2诱导增殖的NCI-H23细胞周期的影响 Figure 8 The effect of DATP on cell cycle of NCI-H23 of E2-induced

图 9(Figure 9)

图 9 DATP对E2诱导增殖的NCI-H23细胞蛋白表达的影响(Western blot) Figure 9 The effect of DATP on protein expression in E2-induced NCI-H23(Western blot)

图 10(Figure 10)

图 10 DATP对E2诱导增殖的NCI-H23细胞蛋白表达的影响 Figure 10 The effect of DATP on protein expression in E2-induced NCI-H23

如图 11~12所示, 与cont相比Notch siRNA可以使NCI-H23细胞ERα表达减少, E2作用后Notch1 siRNA+E2组的ERα表达仍明显低于E2单独作用组, 该结果与图 9~10描述相一致, 并进一步佐证Notch1信号参与调节E2的生物作用.综合图 9~12的提示, 沉默Notch1后ERα表达受到抑制, 抑制Notch1表达一定程度上可以削弱E2的作用.

图 11(Figure 11)

图 11 siRNA对蛋白表达的影响(Western blot) Figure 11 The effect of siRNA on protein expression (Western blot)

图 12(Figure 12)

图 12 siRNA对蛋白表达的影响 Figure 12 The effect of siRNA on protein expression

雌激素是女性体内维持女性健康的重要激素, 是预防女性肺疾病的重要物质.近年来, 人们对雌激素的认识不断加深.研究显示：雌激素参与调节肺癌细胞增殖使女性更易罹患某种类型的肺癌^[5]; 血清雌激素水平和肺癌患者总生存期之间存在负相关关系^[6]; 非小细胞肺癌患者癌组织中雌激素水平高于正常肺组织^[7-8].研究发现雌激素受体水平不仅与肿瘤的形成有关, 还刺激肿瘤细胞侵袭、转移, 因此也与肺癌的转移、复发有关^[9].作为配体雌激素的生理病理作用均离不开其受体, 因此在与雌激素有关的肺癌发生方面雌激素受体的作用不可取代.于肺癌患者癌组织中ERα和ERβ表达量增加均显著.

Notch信号通路为一条高度保守的信号通路, 在细胞间信号传递中发挥重要作用, 主要参与细胞增殖、分化、存活的调控, 是胚胎发育过程中关键的信号通路之一.Notch信号错误可引发多种疾病, 癌症发生时Notch信号通路功能失调.Notch1是Notch受体中具有抑制凋亡、调控细胞周期、促进细胞增殖和存活功能的受体之一, 也是乳腺癌中研究最多的Notch受体.可以通过激活ERα目的基因转录促进乳腺癌细胞增殖、刺激乳腺癌转移等^[10].Notch1在肺发育过程中表达于快速增殖的气道上皮细胞中, 参与肺上皮结构的分化^[11].起初对Notch1在肺癌中的研究结果上是存在矛盾的, 但新近研究一致认为非小细胞肺癌中Notch1表现为致癌作用, 是重要的致癌基因.此外, Notch1还参与干细胞自我更新和增殖的调控, 维持肿瘤干细胞干性, 调节骨髓基质干细胞分化^[12-13].

作为至关重要的信号通路和非小细胞肺癌治疗靶点, Notch信号通路无疑是新兴的.目前关于ERα与Notch信号通路之间关系的研究主要集中于乳腺癌^[14-15].基于二者在乳腺癌中的作用, 我们推测Notch信号将参与雌激素诱导的肺癌细胞增殖.本实验利用NCI-H23细胞观察ERα与Notch信号通路在非小细胞肺癌细胞增殖中的表现.首先利用E2干预确定雌激素对非小细胞肺癌的促增殖作用, 结果显示E2处理后NCI-H23细胞活性增强, 处于增殖期细胞比例增加, 抗凋亡蛋白和细胞增殖相关蛋白表达增加, 说明细胞增殖能力提高, 与现有研究一致; 然后分别采用Notch抑制剂和siRNA干扰的方式判定Notch1是否参与E2诱导的NCI-H23细胞增殖, 结果显示Notch抑制剂和siRNA作用后, Notch1及其目的基因Hes1表达降低, ERα表达减少, NCI-H23细胞增殖能力减弱.因此我们认为Notch1信号通路参与E2诱导的NCI-H23细胞增殖, E2诱导NCI-H23细胞增殖部分依赖Notch1信号.