单宁酸(Tannic acid)又称单宁、鞣酸，是一类多元酚类化合物^[1-2]，具有抗氧化、抗菌和抗病毒、抗肿瘤和抗癌变的作用^[3-4], 广泛地应用于日化、药物、食品和皮革等工业中^[5-6].虽然单宁酸被认为阻碍蛋白质的消化吸收，但是有研究证实其具有降低血压，降低血脂水平，防止肝坏死，并调节免疫反应等生物活性^[7]，因此控制好单宁酸的用量，可作为一种很好的食品添加剂.Ferreira P R B等^[8]在Anacardium humile植物中通过不同方法提取的单宁酸均对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌有抑制效果.Costabile Adele等^[9]在研究中指出1~6 mg/mL单宁酸对于鼠伤寒沙门氏菌具有很强的抑制效果，有望成为农场动物的饲料添加剂.刘超群等^[10]通过热处理单宁酸对冷鲜猪肉中的微生物进行处理，结果显示在2.5 mg/mL时对热死坏丝菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑制效果.张雅丽等^[11]采用五倍子提取出的单宁，对6种常见食品腐败菌和致病菌进行抑菌实验，结果显示对大肠杆菌的效果最小和最低抑菌浓度为0.25 mg/mL.

国内外主要是通过植物中提取单宁酸进行抑菌实验进行研究^[8-16]，但是在利用市售五倍子提取单宁酸进行抑菌实验及其影响因素尚未有报道，这对于单宁酸应用作为食品添加剂有重要的影响.本实验为单宁酸在食品中的应用提供理论依据.

单宁酸(分子式C₇₆H₅₂O₄₆，百分含量：＞98%)：淡棕色轻质无晶性粉末，为五倍子提取物，天津市永大化学试剂有限公司；蔗糖、苯甲酸钠、氢氧化钠、盐酸、乳酸、无水氯化钙、硫酸锌、硫酸铜、柠檬酸、氯化钾、三氯化铁、山梨酸钾均为分析纯.牛肉浸膏、蛋白胨，广东环凯微生物科技有限公司；琼脂，天津市大茂化学试剂厂.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC6538、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC10240、大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC8739、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853、枯草杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633和青霉菌(Penicillium expansum)ATCC7861，由广东工业大学微生物实验室保藏并提供.营养琼脂培养基培养细菌和察氏培养基培养霉菌，121 ℃灭菌30 min.

YXQ-SG46-280S型高压蒸汽灭菌锅，上海市博讯实业医疗设备厂；SW-CJ-1F型紫外无菌超净工作台，苏州市净化设备有限公司；QHZ-98A型电热恒温培养箱，太仓市华美生化仪器厂；FA1604型电子分析天平，上海市衡平仪器仪表厂；pHS-3C型pH计，上海智光仪器仪表有限公司.

滤纸片准备：将吸水性强的滤纸用打孔器打成直径6 mm的圆形小纸片，分装于洁净干燥的小培养皿中，干热灭菌(160 ℃，2 h)后，备用.

菌悬液制备：根据文献[17]，制备菌悬液.

根据文献[18]，按体积比1: 4比例用乙醇-水溶液(1: 4)作为溶剂将单宁酸制成溶液.将滤纸片分别浸入配制好的不同浓度的单宁酸溶液中，另取滤纸片放入乙醇-水溶剂中作对比空白实验，记为0 mg/mL，浸泡24 h.使用前经紫外灯照射20 min进行灭菌处理，再用无菌镊子夹取浸有各种浓度的单宁酸溶液的滤纸片，放入含菌平皿中，同一浓度每皿3片，做3个重复实验.按上述相应条件培养，量取抑菌圈直径，取平均值.观察结果确定单宁酸的抑菌效果.

采用琼脂二倍稀释法^{[11, 19]}测定单宁酸对细菌和霉菌的最低抑菌浓度(MIC)，另取乙醇-水溶液(1: 4)作为对照，记为0 mg/mL，并且用山梨酸钾作为对照.每浓度样品各取5 mL放入不同平皿中，然后分别加入15 mL已灭菌并融化的固体培养基，立刻混匀，此时琼脂平板中单宁酸有所稀释(按稀释浓度计算单宁酸浓度)，待培养基冷却凝固后，各加100 μL供试菌菌悬液于对应琼脂平板上，涂布均匀，细菌于37 ℃恒温培养24 h和霉菌28 ℃中培养48 h后，肉眼观察无细菌菌落形成的最小单宁浓度为最小抑菌浓度，每组重复3次.

由表 1可知，当单宁酸的质量浓度为12.5 mg/mL时候，对6种食品腐败菌均有抑制效果，并且对枯草杆菌的抑制效果最强，抑菌圈达到12.0 mm，其次是藤黄微球菌的抑菌圈为11.1 mm，对大肠杆菌的抑制效果最差，抑菌圈仅为6.0 mm.对供试细菌的抑菌活性依次为：枯草杆菌＞藤黄微球菌＞金黄色葡萄球菌＞青霉菌＞绿脓杆菌＞大肠杆菌，对革兰氏阳性菌的效果明显优于革兰氏阴性菌.单宁酸产生抑制作用的主要原因有破坏细胞壁结构和改变细胞2膜的通透性有关系.由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞膜和细胞壁的区别，革兰氏阴性菌具有细胞壁，它通过它的被覆盖脂多糖限制疏水性化合物的扩散的外膜；革兰氏阳性菌没有外膜，可更容易地渗透，单宁酸会干扰细胞质膜，扰乱细胞内物质，细胞膜电位和膜外部主动运输^[20].而大肠杆菌的抑菌活性较低，因为将大肠杆菌放置在包含单宁酸的营养物质中，其会修饰单宁酸从而达到降解作用^[21].

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度单宁酸的抑菌效果1) Table 1 Antibacterial activities of tannic acid in different concentrations 抑菌成分 质量浓度/(mg·mL-1) 抑菌圈直径/mm 藤黄微球菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 绿脓杆菌 枯草杆菌 青霉菌 单宁酸 25.00 13.0±0.1 9.8±0.3 6.3±0.3 11.4±0.1 12.6±0.1 12.2±0.1 单宁酸 12.50 11.1±0.3 8.6±0.1 6.0±0.3 10.1±0.1 12.0±0.1 10.4±0.3 单宁酸 6.25 9.7±0.3 8.0±0.2 5.5±0.4 8.8±0.3 10.3±0.3 9.2±0.3 单宁酸 3.12 8.0±0.2 7.1±0.2 - 8.2±0.2 8.4±0.2 8.3±0.1 单宁酸 1.56 7.1±0.2 - - 7.2±0.3 7.3±0.3 8.0±0.3 单宁酸 0.78 6.2±0.3 - 6.2±0.3 6.8±0.2 7.8±0.2 1)“-”为没有抑菌圈

表 1 不同浓度单宁酸的抑菌效果1) Table 1 Antibacterial activities of tannic acid in different concentrations

按照1.2.3的方法对食品中的几种腐败菌的最低抑菌浓度进行分析.结果如表 2和表 3所示.表中，“-”表示无菌生长；“+”表示平板上菌落密度为0~20 CFU/cm²；“++”表示平板上菌落密度为20~100 CFU/cm²；“+++”表示平板上菌落密度为100~200 CFU/cm²；“++++”表示平板上菌落密度大于200 CFU/cm².下同.

表 2(Table 2)

表 2 单宁酸对各菌的最低抑菌质量浓度 Table 2 The minimal inhibitory concentration of tannic acid on different pathogens 供试菌 单宁酸质量浓度/(mg·mL-1) 12.50 6.25 3.12 1.56 0.78 0.39 0.19 0.09 0 藤黄微球菌 - - - - - - - + ++++ 金黄色葡萄球菌 - - - - - - + +++ ++++ 枯草杆菌 - - - - - - + +++ ++++ 大肠杆菌 - - - - - + ++ +++ ++++ 绿脓杆菌 - - - - - + ++ +++ ++++ 青霉菌 - - - - - + ++ ++ ++++

表 2 单宁酸对各菌的最低抑菌质量浓度 Table 2 The minimal inhibitory concentration of tannic acid on different pathogens

表 3(Table 3)

表 3 单宁酸、山梨酸钾对各菌的最低抑菌浓度(MIC)比较 Table 3 The comparison of MIC between tannic acid and potassium sorbet 供试菌 MIC/(mg·mL-1) 山梨酸钾 单宁酸 藤黄微球菌 ＞6.25 0.19 金黄色葡萄球菌 ＞6.25 0.39 枯草杆菌 ＞6.25 0.39 大肠杆菌 ＞6.25 0.78 绿脓杆菌 ＞6.25 0.78 青霉菌 ＞6.25 0.78

表 3 单宁酸、山梨酸钾对各菌的最低抑菌浓度(MIC)比较 Table 3 The comparison of MIC between tannic acid and potassium sorbet

由表 2可知，单宁酸对藤黄微球菌的MIC为0.19 mg/mL，对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的MIC均为0.39 mg/mL，对大肠杆菌和绿脓杆菌和青霉菌的MIC均为0.78 mg/mL.由表 3可知，山梨酸钾对各供试菌的最低抑菌质量浓度均大于6.25 mg/mL.可以观察到单宁酸对各供试菌的最低抑菌浓度均要小于山梨酸钾，单宁酸有望成为优于山梨酸钾的天然防腐剂，单宁酸作为天然食品防腐剂具有较好的开发前景.

选取对应供试菌的最小抑菌浓度低一个浓度梯度，然后将单宁溶液pH值分别调为3、4、5、6、7、8，采用1.2.3方法测定单宁酸的抑菌活性，观察并比较在不同pH值环境下对单宁酸抑菌效果的影响，结果如表 4所示.

表 4(Table 4)

表 4 pH对单宁酸抑菌效果的影响 Table 4 Effect of pH value on the antimicrobial activities of tannic acid 供试菌 样品 pH 3 4 5 6 7 8 藤黄微球菌 单宁酸 - + + + + ++ 对照 +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ 金黄色葡萄球菌 单宁酸 - + + + + + 对照 +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ 枯草杆菌 单宁酸 - + ++ +++ ++ ++ 对照 ++ +++ +++ ++++ ++++ +++ 大肠杆菌 单宁酸 - + + ++ ++ +++ 对照 +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ 绿脓杆菌 单宁酸 - + + + + + 对照 ++ +++ +++ +++ +++ ++ 青霉菌 单宁酸 - + ++ ++ +++ +++ 对照 +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++

表 4 pH对单宁酸抑菌效果的影响 Table 4 Effect of pH value on the antimicrobial activities of tannic acid

由表 4可知，单宁酸在酸性条件下比碱性条件下的抑菌效果效果更好，呈现出由酸到碱菌落密度增大的趋势，pH在3~7时显示出良好的抑菌效果，在pH为8时，只有金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌有较好的抑制效果.所以，单宁酸作为酸性食品的添加剂，作用效果最好.

在培养基中分别添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%质量分数的乳酸和柠檬酸，观察并比较不同质量分数有机酸对单宁酸抑菌的影响，结果如表 5所示.

表 5(Table 5)

表 5 乳酸和柠檬酸对单宁酸抑菌效果的影响 Table 5 Effect of the lactic acid and citric acid on the antimicrobial activities of tannic acid 供试菌 样品 乳酸质量分数/% 柠檬酸质量分数/% 0 0.5 1.0 1.5 2.0 0 0.5 1.0 1.5 2.0 藤黄微球菌 单宁酸 + - - - - + - - - - 对照 ++++ +++ ++ - - ++++ +++ + - - 金黄色葡萄球菌 单宁酸 + + - - - + + + - - 对照 +++ +++ + - - ++++ +++ ++ - - 枯草杆菌 单宁酸 +++ + - - - ++ + + - - 对照 ++++ ++ + - - ++++ +++ ++ + - 大肠杆菌 单宁酸 ++ + + - - + + + - - 对照 ++++ +++ + + - ++++ +++ +++ - - 绿脓杆菌 单宁酸 ++ + - - - ++ + - - - 对照 ++++ ++ + - - ++++ ++ - - - 青霉菌 单宁酸 ++ + - - - ++ + + - - 对照 ++++ +++ +++ ++ - ++++ +++ +++ ++ ++

表 5 乳酸和柠檬酸对单宁酸抑菌效果的影响 Table 5 Effect of the lactic acid and citric acid on the antimicrobial activities of tannic acid

由表 5可知，添加1%的乳酸有一定的抑制细菌生长的作用，但是对大肠杆菌的抑制效果乳酸添加量要达到1.5%.单宁酸的抑菌作用总体比乳酸效果要强.当单宁酸与低浓度乳酸同时使用时，能够表现出十分优秀的抑菌效果，且比单独使用单宁酸或者乳酸的作用强.乳酸作为天然短碳链有机酸，有研究表明其会通过竞争性抑制干扰菌体内部的脯氨酸氧化酶合成，从而扰乱细菌的代谢途径，使细菌死亡^[22].

当单宁酸和柠檬酸联合使用时，会提高单宁酸的抑菌效果.添加1.5%的柠檬酸基本上对6种供试菌有抑制效果.对比单宁酸和乳酸的联合使用效果，藤黄微球菌在两种酸条件下，抑菌效果相当；但其余5种供试菌在单宁酸和柠檬酸联合使用下的抑制效果要比单宁酸和乳酸联合使用差.而据相关文献提示，单宁酸与两个有机酸均可能有相互之间的协同作用，可做进一步研究^[23].有机酸与单宁酸协同使用作为食品添加剂有很好的应用前景.

选取对应的最小抑菌浓度低一个浓度梯度下的单宁酸溶液，在培养基中加入不同量的NaCl，调节培养基中氯化钠质量分数分别为1%、3%、5%、7%，参照1.2.3方法，结果如图 1所示.在培养基中加入不同量的蔗糖，调节培养基中蔗糖质量分数分别为2%、4%、6%、8%、9%，观察并比较不同蔗糖质量分数对单宁酸抑菌的影响，结果如图 2所示.

图 1(Figure 1)

图 1 氯化钠浓度对单宁酸抑菌效果的影响 Figure 1 Effect of the concentration of NaCl on the antimicrobial activities of tannic acid

图 2(Figure 2)

图 2 蔗糖浓度对单宁酸抑菌效果的影响 Figure 2 Effect of the concentration of sucrose on the antimicrobial activities of tannic acid

由图 1可知，不同质量分数的氯化钠对单宁酸的抑菌效果并没有产生影响，而氯化钠本身质量分数的提升就对供试菌有越来越好的抑制作用.单宁的加入使氯化钠的抑菌浓度大大降低，有利于减少食品中食盐的使用量，促进人们饮食健康.因此，单宁酸在不同浓度的盐条件下，抑菌效果比较稳定.

由图 2可知，枯草杆菌和青霉菌在单宁酸处理下，对于蔗糖质量分数变化的影响效果较大，其他4种供试菌总体上在较低质量分数的蔗糖溶液下，其抑菌活性没有明显变化.而糖类作为微生物的碳源，可以提供细菌生命活动所需的能量，或调节细菌新陈代谢，促进细菌的生长.因此蔗糖质量分数的增加，会促进供试菌的生长.说明单宁酸能广泛适用于较低蔗糖浓度的饮料食品中.

用氯化钙、氯化钠、氯化钾调节培养基中Ca²⁺、Na⁺、K⁺质量浓度为1 000 mg/L，用硫酸铜、氯化铁、硫酸锌调节培养基中Cu²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺质量浓度为1 mg/L，观察并比较不同金属离子对单宁酸抑菌的影响.由图 3可知，在Fe³⁺和Ca²⁺的存在条件下，培养基的菌落总数增加，对单宁酸的抑菌效果稍微减弱，但是未见对抑菌作用产生强烈减弱.理论上，Ca²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺离子能够与单宁上众多的酚羟基发生络合反应^[24]，导致单宁酸中主要起抑菌作用的酚羟基被屏蔽，而失去了原有的化学性质，从而降低了单宁的抑菌活性，但这些离子在复杂的食品体系中没有影响单宁的抑菌效果.

图 3(Figure 3)

图 3 金属离子对单宁酸抑菌效果的影响 Figure 3 Effect of the metal ion on the antimicrobial activities of tannic acid

单宁酸对6种食品中常见的腐败菌有抑制作用，与常见食品防腐剂山梨酸钾相比，单宁酸的最低抑菌浓度比较低.单宁酸具有广泛的酸碱使用范围，酸性条件更有利于单宁的抑菌活力，低质量分数(0.5%)的乳酸或柠檬酸与单宁酸协同处理时有更好的抑菌效果.氯化钠、蔗糖、金属离子均未对单宁的抑菌作用产生影响，在盐腌、糖腌制品中添加单宁能有效降低食盐或食糖的使用量，有利于健康生活.