硝基咪唑类(misonidazole, MISO)化合物因为具有明显的抗菌活性以及其他一些生理活性，所以被广泛应用于抗病毒、抗寄生虫、抗结核等临床药物^[1-3].此外，近年来有文献报道，MISO化合物具有合适的氧化还原电位，它可以通过弥散进入细胞内.硝基在细胞内酶(主要是黄嘌呤氧化酶)的作用下发生单电子还原，产生自由基阴离子.在正常的细胞中，由于氧化硝基具有更高的电子亲和力，自由基阴离子又能被迅速再氧化为原化合物，扩散到细胞外；在乏氧细胞中，自由基阴离子被进一步还原直至变成胺基，由于胺基能与细胞里的大分子共价结合，使得药物在乏氧细胞里滞留与积累.利用MISO化合物的这种特性可以探测肿瘤细胞的乏氧程度, 因而可以作为抗肿瘤的放射增敏剂、放疗增效剂和乏氧组织显像药物^[4-6].

基于上述MISO化合物对于肿瘤乏氧细胞选择性结合的靶向原理，本研究小组致力于对多胺多羧酸(乙二胺四乙酸，二乙三胺五乙酸)的基本骨架用硝基咪唑类化合物进行化学修饰，设计合成具有双功能基团的配体，用于靶向性磁共振成像造影剂或者放射性乏氧显像剂的研发.采用酸酐醇解或者酰化是对多胺多羧酸的骨架进行化学修饰的常用方法之一，国内外多个研究小组利用这种方法先后报道了多种新型靶向造影剂^[7-10].采用这种常规的酸酐醇解法，通过将乙二胺四乙酸双酐(ethylenediamine-tetra-acetic acid anhydride, EDTAA)与硝基咪唑类化合物甲硝唑(metronidazole, MN)进行酯化反应，发现副产物(主要为单酯化产物)较多，而且粗产物需要柱色谱分离纯化，收率低，耗时长，成本高.

近年来微波辐射技术已经广泛应用于酯化、水解、氧化等多种有机反应，取得了很大的进展.与传统合成方法相比，微波合成技术能使有机合成反应时间明显缩短，减少环境污染，提高收率，降低成本，能使那些后处理比较困难的合成工艺变得容易进行，获得节能、降耗和减排的效益，被誉称为“21世纪的有机化学”.本文将微波辐射法用于EDTAA与MN的酯化反应，设计正交实验，考察了物料比、反应时间和反应温度等对反应收率的影响，为多胺多羧酸酯类衍生物的合成提供一种简洁、方便、有效的新方法.

X-4型数字显微熔点仪(温度未校正，北京泰克仪器有限公司)；Nicolet380型傅立叶变换红外光谱仪(KBr压片，美国Thermo公司)；PE2400型元素分析仪(美国PE公司)；Varian Mercury plus 400型核磁共振仪(美国Varian公司)；Agilent1290-Bruker Maxis impact高分辨液相色谱质谱联用仪(德国Bruker公司)；Discover S-class型全自动微波反应器(美国CEM公司).

所用试剂均为分析纯；无水溶剂均按标准方法纯化.

在氮气保护下，向装有30 mL无水吡啶(pyridine, Py)和20 g(0.068 mol)乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)的反应瓶中缓慢滴加25 mL(0.255 mol)乙酸酐(acetic anhydride, AA)，共约需20 min，然后升温至60 ℃，搅拌回流反应24 h.冷却，抽滤，所得固体用乙酸酐洗至无琥珀色(浅黄色)，N, N-二甲基甲酰胺(dimethyl formamide, DMF)-乙醚(diethyl ether, dee)重结晶，得纯白色粉末，收率87%，m.p.：191~193 ℃(文献[7]值：190 ℃)；FT-IR(KBr，cm^-1)：1 808.7，1 761.7(ν_C=O酸酐羰基)，1 067.0 (ν_C-O-C)；Anal. calculated for C₁₀H₁₂N₂O₆：C 46.87，H 4.69，N 10.94；found C 46.81，H 4.72，N 10.89.

将1.99 g(6 mmol)EDTAA、2.00 g(12 mmol)MN、0.5 g 4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine, DMAP)和15 mL无水吡啶混合后放入35 mL压力反应罐中，反应罐置于微波反应器，设置固定功率300 W，将温度从室温升至110 ℃，保持此温度下反应30 min.反应完毕，自然冷却后蒸除吡啶，得黄色半固体混合物，加入乙醚后研磨得粗产物.用适量冰水将其溶解，再用适量预冷过的0.5 mol/L柠檬酸(citric acid, CA)溶液调pH至5.0左右，于4 ℃冰箱内放置48 h.过滤，用适量无水乙醚或丙酮(acetone, ACTN)洗涤沉淀，再用无水乙醇(ethanol, e)重结晶，得白色粉末，收率达80%，m.p.：90~93 ℃(文献[11]值：92~94 ℃)；FT-IR(KBr，cm^-1)：3 434.1(ν_OH)，1748.3(ν_C=O，酯羰基)，1 364.2、1 529.4(ν_NO2)，1189.5、824.7(ν_C-O-C)；¹HNMR(D₂O)：δ(×10^-6)：2.46(s，6H，N=C-CH₃)，3.13[s，4H，N(CH₂)₂N]，3.61(s，4H，N-CH₂-COOC)，3.88(s，4H，N-CH₂-COOH)，4.51(t，4H，-CH₂-)，4.65(t，4H，-CH₂-)，7.98(s，2H，C=C-H)；HRMS(ESI，positive mode): C₂₂H₃₀N₈O₁₂ for [M+Na]⁺，calculated 621.188 1，found 621.187 5；Anal. calculated for C₂₂H₃₀N₈O₁₂：C 44.15，H 5.02，N 18.73；found C 44.06，H 5.08，N 18.81.

虽然羧酸可以与醇直接发生酯化反应，但是为可逆反应，一般是反应较慢、产率较低.因而，本文首先将EDTA环化成活性较好的双环酸酐.双环酸酐与醇的酯化反应虽然较羧酸与醇的酯化反应为快，但是如果采用常压加热回流的方法，需要较长的反应时间，而且产物中有单酯化合物、同侧的不对称的二酯化合物以及对称的双酯化合物，需要用柱色谱进行分离，产率一般为60%~70%.本文采用微波法进行酯化反应，通过优选合成条件(反应物配比、反应温度、反应时间、溶剂、催化剂等)可以快速、高效合成含硝基咪唑的有机配体，反应时间缩短到20~30 min, 由于粗产物中副产物较少，通过重结晶方法即可纯化得到，产率都在80%以上.

一般酯化常用溶剂为非质子极性溶剂，如N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、N, N-二甲基乙酰胺(N, N-dimethylacetamide, DMAC)、二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)或N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone, NMP)等.但实验表明，在制备EDTA-2MN时，含硝基咪唑的原料在这些溶剂中溶解度不大，而且反应结束后溶剂也不容易除去，所以使得后处理很不方便.考虑到酯化反应常用吡啶作为催化剂，本文就选择吡啶作为酯化反应溶剂，吡啶环上的N原子可以与活泼氢成盐，提高反应物或者中间体的溶解度，从而加快反应速率，另外吡啶盐容易通过水洗的方法除去.另外，为了进一步加快反应，加入少量4-二甲胺基吡啶(DMAP)作为催化剂，在DMAP中，吡啶环的N原子上连接的两个甲基具有斥电子效应，致使氮原子的电子云密度增大，使DMAP的偶极距(4.40 D)比吡啶(2.23 D)增大很多，亲核性也明显随之增强^[12-14].DMAP与双酸酐可以形成稳定的N-酰化吡啶盐，该盐分子的中心电荷比较分散，可以形成一个连接不紧密但稳定的N-酰基吡啶离子对，这个离子对可以快速与醇反应形成酯，重新释放出DMAP，反应过程如图 1所示.这样的设计不仅加快了反应速率，而且更容易生成对称结构的双酯产物EDTA-2MN，提高产率.

图 1(Figure 1)

图 1 DMAP催化酯化反应示意图 Figure 1 Scheme of esterification reaction catalyzed by DMAP

采用微波辐射合成EDTA-2MN，影响反应产率的因素较多，在单因素初步研究结果的基础上，本文确立了物料比(A)、反应时间(B)和反应温度(C)等3个因素作为考察对象进行了正交实验.正交实验的因素与水平见表 1，选用3因素3水平正交表L₉进行实验，结果见表 2.通过考察反应的收率，用极差分析、方差分析实验结果，见表 3.以上分析都在SPSS17.0软件下进行.

表 1(Table 1)

表 1 正交设计的影响因素与水平 Table 1 Influencing factors and levels of orthogonal experiment 水平 因素 A 物料比 B 反应时间/min C 反应温度/℃ 1 1:2.0 30 110 2 1:2.5 35 120 3 1:3.0 40 130

表 1 正交设计的影响因素与水平 Table 1 Influencing factors and levels of orthogonal experiment

表 2(Table 2)

表 2 正交实验结果及极差分析 Table 2 Results of orthogonal experiment and range analysis 序号 影响因素 产率/% 物料比 (A) 反应时间 (B) 反应温度 (C) 误差 (D) 1 1 1 1 1 55.8 2 1 2 2 2 68.6 3 1 3 3 3 69.5 4 2 1 2 3 75.3 5 2 2 3 1 83.5 6 2 3 1 2 78.4 7 3 1 3 2 65.7 8 3 2 1 3 62.5 9 3 3 2 1 67.6 k11) 0.646 0.656 0.656 - - k21) 0.791 0.715 0.705 - - k31) 0.653 0.718 0.729 - - R2) 0.145 0.062 0.073 - - 1)边际均值；2)极差

表 2 正交实验结果及极差分析 Table 2 Results of orthogonal experiment and range analysis

表 3(Table 3)

表 3 正交设计方差分析结果 Table 3 Results of variance analysis of orthogonal experiment 因素 离均差平方和 自由度 均方 F值 P值 物料比(A) 0.040 2 0.020 57.059 0.017 反应时间(B) 0.007 2 0.004 10.599 0.086 反应温度(C) 0.008 2 0.004 11.990 0.077 误差(D) 0.001 2 0.000 - -

表 3 正交设计方差分析结果 Table 3 Results of variance analysis of orthogonal experiment

由微波辐射条件L₉(3⁴)正交实验结果和表 2中的极差分析可知，物料比的极差值(0.145)最大，其次是反应温度，反应时间极差值(0.062)最小，即各因素的影响顺序为物料比＞反应温度＞反应时间.表 3正交设计方差分析结果显示，按照α=0.05的检验水准，物料比(A)对EDTA-2MN产率的影响具有统计学意义(P=0.017)，物料比的最佳水平为1: 2.5，其余两个因素的影响并不显著.从经济、安全、可行的角度出发，确定反应的最佳时间为30 min，反应温度为110 ℃，所以最优实验条件组合为A2B1C1.在此最优条件下进行3次重复验证实验，产物收率都在80%左右，重复性好.采用常规加热法合成类似的双酯化合物，文献[15-16]报道在60~70 ℃需要反应24 h，产率约44%~55%.因而本文报道的合成技术在减少环境污染、提高收率、降低成本和反应时间方面具有显著的优势.

图 2是目标化合物EDTA-2MN的红外光谱图.图中，3 434.1 cm^-1的强峰为羧基-OH的伸缩吸收峰；1 748.3 cm^-1为酯的羰基的伸缩吸收峰；1 529.4 cm^-1和1 364.2 cm^-1为NO₂的两个伸缩振动吸收峰；1 189.5 cm^-1和824.7 cm^-1可归属为ν_C-O-C的伸缩振动峰^[17].

图 2(Figure 2)

图 2 EDTA-2MN的红外光谱图 Figure 2 IR Spectra of EDTA-2MN

目标化合物EDTA-2MN的氢谱¹HNMR(溶剂D₂O)如图 3, 其数据及其归属δ(×10^-6)：2.46(s，6H，N=C-CH₃，H_g)，3.13[s，4H，N(CH₂)₂N，H_a]，3.61(s，4H，N-CH₂-COOC，H_c)，3.88(s，4H，N-CH₂-COOH，H_b)，4.51(t，4H，-CH₂-，H_e)，4.65(t，4H，-CH₂-，H_d)，7.98(s，2H，C=C-H，H_f).这进一步确证了化合物EDTA-2MN的结构.

图 3(Figure 3)

图 3 EDTA-2MN的1HNMR氢谱图 Figure 3 1HNMR Spectra of EDTA-2MN

采用ESI技术正离子模式测试目标化合物EDTA-2MN的高分辨质谱图，它的M+ Na峰为621.187 5，与理论计算值621.188 1相吻合，依质谱测得分子量推测目标化合物的分子式为C₂₂H₃₀N₈O₁₂，故元素分析的结果进一步确证了该分子式.

采用微波技术合成了目标化合物EDTA-2MN，继而通过红外光谱、核磁共振氢谱、质谱及元素分析对产物进行表征.设计正交实验确定了微波反应的最优实验条件：EDTAA与MN物料比1: 2.5，反应时间30 min，反应温度110℃，收率达到80%以上，与采用常规加热法相比，本文的方法具有反应时间短、收率高、成本低、绿色环保等显著特点.化合物EDTA-2MN的生物活性正在进一步研究当中.