2015, Vol. 32
2. 华南理工大学 土木与交通学院，广东 广州 510006
2. School of Civil Engineering and Transportation, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China
白色污染是当前危害社会环境的社会性公害.这类由石油化工工业中的高分子化合物制成的塑料制品，被弃置后需要200～400年的时间才能完全降解.该问题推动了降解塑料的开发和应用[1].
聚羟基烷基酸酯(PHA)是一类由微生物在N、P、微量元素等营养缺乏，碳源充足的不均衡条件下合成的细胞内能源物质[2].PHA是具有与聚乙烯类石油基塑料类似的力学性能，同时也具有生物可降解性和生物相容性等特性的新型环保材料.但是，生产PHA的主要方法，即纯菌株发酵培养，成本居高不下，限制了PHA的普及化.
城市污水的生物处理过程产生大量活性污泥，其中存在大量能合成PHA的微生物.利用活性污泥中的混合菌，驯化得到PHA贮存能力强的菌群，再以制糖、啤酒等行业产生的有机废水中小分子有机酸等为底物，一方面大量合成PHA，另一方面达到除磷脱氮的效果.
目前，利用活性污泥合成PHA的产率尚低于纯菌株，但通过选择合适工艺，探索并优化工艺条件，将提高PHA的产率.
本文重点讨论优化活性污泥混合菌群生产PHA的工艺条件；简单阐述PHA的生产及应用过程中存在的问题，并指出后续研究方向.
1 国内采用混合菌合成PHA的研究 1.1 混合菌的驯化国内PHA合成实验主要采用厌氧/好氧活性污泥法和好氧瞬时供料法，让活性污泥中混合菌群能够利用废物中营养成分，储存PHA，可以维持不均一生存条件下相对稳定的生长和生存[3].
1.1.1 厌氧-好氧活性污泥工艺该工艺是指微生物都能够在厌氧/好氧交替条件下，在厌氧段时以PHA的形式在细胞内储存能源，在好氧条件下消耗内碳源.
在驯化阶段，采用限磷和限氮两种方式均有助于活性污泥中的混合菌群合成PHA.陈志强等[4]实验在限磷条件下(w(C): w(N): w(P) = 100: 5:0.5)，PHA产量可占到细胞干重的35%.而限氮条件下(w(C): w(N): w(P) =100: 2.5: 1)，PHA合成量达到最高, 能达到污泥干重的40%.Ruan等[5]研究表明单—控制磷源含量，经15～20 d驯化，获得富含PHA约20%细胞干重(CDN)比例的活性污泥.在限氮和限磷的情况下，还控制pH值.初始pH值高不利于聚糖菌(GAOs)的生长但有利于PHA量的贮存[6].
聚糖菌(GAOs)是已驯化得到的一种PHA合成主要微生物.其脱氢酶活性、生长速率及对有机酸的利用能力与底物浓度和驯化时间有关.研究表明，长期高丙酸/乙酸驯化对GAOs有抑制作用[6-8].混合菌经过驯化，污泥中PHA含量有明显增幅.王玉洁等[9]将取回的多种活性污泥经3000 r/min离心20 min后, 以85～120 g/L湿重加入SBR中进行驯化，从而进行高密度培养.经驯化培养后, 所有污泥中的PHA含量均大幅提高，其中珠江啤酒厂活性污泥中的PHA含量达10.5%，增加了105倍，镜检发现驯化后的污泥中丝状菌的数量和胞内PHA的产量均有所增加，经鉴定为球衣菌，编号为W99136.
陈志强等[10]从活性污泥中分离到1株能够利用丁酸合成PHA的细菌WD-3，当w(C)/w(N)为35, pH为7.0时, WD-3的PHA合成能力最高.在最佳培养条件下, 细胞生长达到稳定期时, 该菌PHA产量高达3.01 g/L，占细胞干重的45.4%, 且PHV所占比例达到1/3.经16S rRNA基因测序分析，初步确定该菌属于γ-变形菌亚纲中的肠杆菌.
李晓雁等[11]采用的驯化活性污泥方式为好氧/微好氧/沉淀，确定最佳碳源为乙酸钠，所得PHA的量从占污泥MLVSS的2.36%提高到21.19%.研究中利用DNA指纹图谱分析与探针标记和杂交技术结合，从驯化后污泥样品中筛选出适应特定工艺条件，并能够在此工艺下长期存在的PHA合成优势菌CAMP11(芽孢杆菌属).把CAMP11加入活性污泥并进行驯化，主要产物为羟基丁酸与羟基戊酸组成的共聚物(PHBV)，其PHA总量高达污泥MLVSS的32.08%.
1.1.2 好氧瞬时供料工艺该工艺是通过控制反应器中的底物浓度, 使微生物处于底物时而丰富时而匮乏的状态, 以抑制微生物的生长, 驯化出具有强大PHA贮存能力的菌群.
该工艺在好氧/缺氧时间比为1: 3时最有利于培养系统维持稳定并存储PHA.陈红等[12]在该时间比下驯化活性污泥，获得最高PHA含量(48.6%)，以及最高合成速率5×10-8 g/s.
张琦等[13]使用双阶段驯化模式，得出乙酸利用率为27.3 mg/(L·min)，PHA单位乙酸合成效率提高到0.24 g/g，PHA含量在进水后30 min时达到最大值，各项指标相比单阶段驯化模式均有提高.但是双阶段驯化模式耗时过长.
许振岚[14]认为驯化是个长期的过程，长时间的氨氮、磷浓度受限，使微生物的生长长期收到限制，将导致MLSS减小，会使底物的消耗速率和PHA的合成受到较大的影响.通过优化实验得到最佳驯化条件为:SRT为15 d，w(C)/w(N)为50，w(C)/w(P)为530，COD0为1.050 kg/m3，至驯化结束最大得率为0.73，驯化时间为25 d.
大量实验均采用乙酸、丙酸等纯物质作为原料，吴海云等[6]利用食品废弃物和剩余污泥混合发酵产有机性挥发酸(VFAs)作为活性污泥合成PHA的廉价碳源.培养20 d后驯化体系达到稳定, 稳定后发酵所得VFAs浓度为4.0±0.15 kg/m3，VFAs中丁酸含量最高, 其次为戊酸, 丙酸和乙酸含量相对较少.随后的优化实验中，最高VFAs浓度实验值29.099 kg/m3相应控制条件:食品废弃物含量88.03%，pH为6.99，系统反应时间8.92 d，有机负荷9.62×10-8 kg/s.最高VFAs/SCOD比实验值89.91%，相应控制条件：食品废弃物含量92.12%，pH为7.18，系统反应时间6.26 d，有机负荷4.93×10-8 kg/s.这可为后续PHA合成的工业化提供大量廉价碳源，值得对其他污泥进行更多研究.
1.2 PHA积累许多研究通过驯化得到高效的PHA合成菌群，并在PHA积累过程进行条件优化选择，以提高PHA的贮存量.影响因素包括底物浓度，碳源类型，溶解氧浓度，氧化还原电位，pH，温度等.
1.2.1 COD浓度活性污泥合成PHA的最大产率与进水COD浓度在一定范围内呈正相关.陈玮等[15]实验发现，当进水COD为300～800 mg/L时，PHA产率随进水COD浓度的升高而增大，PHA含量最高可达21%.而当进水COD继续提升至1000 mg/L时，PHA产率的提升不明显.陈红等[12]在有机负荷为5.42 kg/m3时, PHA含量可达48.6%，当有机负荷为0.72 kg/m3时, PHA的合成速率最高达到5×10-8 g/s.针对COD浓度过高对微生物合成PHA反应产生抑制作用的问题，有研究发现，分批次加入底物可消除这种抑制作用[5].分批次加入底物不仅提高了PHA的质量分数，还使得PHA的生产时间大大缩短.
1.2.2 碳磷比和碳氮比保证碳氮比不变，探究磷元素的影响.陈玮等[15]发现，在w (C): w (P)为250: 1时PHA最大积累量达到27%，w (C): w (P)为750: 1时PHA最大积累量达到37%.而陈志强等[4]得出利用活性污泥合成PHA在限氮条件下更有利，当w (C)：w (N)为125: 1时，获得了PHA的积累的最大值占到细胞干重的59%.但是，污泥状态持续3 d左右，丝状菌大量繁殖，导致系统崩溃.限氮过量和限磷过量分别会引起丝状菌膨胀和黏性水膨胀.PHA高产的同时控制污泥不膨胀是目前利用活性污泥中混合菌群合成PHA需要解决的重要问题.
1.2.3 不同类型碳源在活性污泥中提供不同碳源，会合成不同表现型的PHA.黄惠珺等[16]实验结果表明，进水n(乙酸): n(丙酸)= 1: 2条件下系统内PHA和PHB含量最多, 分别为6.0和4.25 mol/m3.同时，系统也可以利用甲醇、乙醇、淀粉及生活污水作为碳源物质进行底物贮存，贮存物以PHB为主，PHB分别占PHA总量92%、88%、85%、70%，但贮存量较乙酸及丙酸低.李金娟等[17]研究表明，淀粉废水酸化产物为丁酸、乙酸、丙酸、乙醇、戊酸.以此酸化产物为碳源经活性污泥合成PHA，PHA含量为34.7%.核磁共振图谱结果分析，此PHA样品含有HB和3HV，3HV的含量占8.9%.
目前，已经商品化的PHA产品有PHB、PHBV和PHBHHx.上述研究中碳源均为纯物质，所以学者还需对利用剩余污泥发酵得到的碳源所合成的PHA类型进行研究.使更多类型的PHA产品实现工业化、商品化.
1.2.4 不同磁场强度的响应分析适当强度的磁场对PHA合成酶有促进作用.陈红等[12]实验发现，在磁场强度从0 mT逐步增加到30 mT的过程中, 活性污泥中HB，HV的含量开始随着磁场强度的增加而增加，到达某个点后又会随着磁场强度的增加而降低.活性污泥中HB含量在磁场强度为7 mT时达到最高(33%)；活性污泥中HV含量在磁场强度为21 mT时达到最高(12%)；当磁场强度为11 mT时，活性污泥中PHA含量最高(40%).吴海云[6]实验表明，不加磁场条件下最终得到的转化率为20.5%；7 mT磁场条件下得到的转化率为23.2%，与21 mT磁场条件下接近.同时有研究[14]建议控制pH值在较高水平(8.5～9.5之间)，并且当磁场强度为21 mT，SRT为5 d，活性污泥合成PHA的能力均较大.
1.2.5 溶解氧(DO)活性污泥中合成PHA的菌群有厌氧菌群和好氧菌群.有研究表明：以乙酸钠为碳源培养的活性污泥低DO浓度和高DO浓度均会较大程度影响PHA的降解速率[18].以葡萄糖为碳源培养的活性污泥PHA受DO影响不大.蔡萌萌等[19]研究表示，采取微氧/好氧工艺能有效解决厌氧/好氧工艺中PHA产量低的问题.原因是PAOs/GAOs菌群会在厌氧条件下并非全部碳源转化为PHA, 而是把部分碳源转化成肝糖元.代谢途径复杂化会降低PHA的合成效率.而微氧时菌群摄取外界碳源，产生较少量PHAs.好氧时菌群快速降解外界碳源，同时合成大量PHA，比相同情况下厌氧/好氧工艺的PHA产量多40%.
2 国外采用混合菌合成PHA的研究 2.1 微生物驯化驯化得到PHA贮存能力强的微生物是混合菌条件下一个重要的挑战.如果选择得到的微生物群PHA贮存能力不均一，会对出水有不良影响.贮存能力低的微生物也增加PHA提取的成本.值得注意的是，优化驯化过程需要得到具有PHA合成能力高且稳定的均一微生物群，而不是使PHA含量最大化.后者应该是在积累过程完成.
2.1.1 AN/AE工艺大量研究是针对已驯化得到的两种主要微生物，即聚磷菌(PAOs)和聚糖菌(GAOs).研究表示，GAOs比PAOs表现出更强能力，通过吸收简单底物更容易合成共聚物P(3HB-co-3HV)且能达到更高的PHA含量[20].
近几年，研究得到GAOs丰富的微生物群，其表现出较强的PHA合成能力.
Dai等[20]利用乙酸驯化得到了含75%GAOs的微生物群，该微生物群合成的PHA含70%3HB和30%3HV，这种产物具有与商用PHA类似的性能.根据FISH的分析，驯化得到的生物群落主要包括变形菌门和变形杆菌门的细菌.但其PHA含量很低，只占细胞干重的14%.
Bengtsson等[21]采用厌氧/好氧SBR工艺，使用预发酵造纸废水驯化培养GAOs丰富的微生物群.反应系统表现出稳定的PHA合成量，产物组成为m(3HB): m(3HV):m(3H2MV)=35: 60: 5.菌群在厌氧条件下贮存PHA量达到细胞干重的30%，在好氧条件下达到25%.糖蜜废液含有大量的糖类和氨基酸等营养物质供微生物生长[22].
Pisco[23]使用富含挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)的发酵蜜糖废水，驯化得到具有较强的PHA贮存能力的GAO菌群.这个菌群的PHA贮存量达到细胞干重37%.产物主要由3HB, 3HV, 3HHx和少量3H2MB和3H2MV组成.
2.1.2 ADF工艺学者们在ADF条件下使用了较复杂的废物驯化微生物，例如：发酵蔗糖蜜[24]，发酵棕榈油厂废水(POME)[25]，含有甲酸、甲醇和乙二醇的工业废水[25]，番茄罐头工厂废物[26]，发酵造纸厂废水[27]和发酵啤酒厂废水[28].
大量驯化过程运行条件得到试验.Albuquerque[24]在研究发酵蔗糖蜜中，采用SBR工艺，pH不受控的条件下，运行周期为12 h，SRT为10 d，1.4和2.5 mol/m3, 25℃，两个有机负荷1.39×10-6和6.94×10-7 mol/s.学者证明饥饿/丰盛的有机负荷比例是富集培养过程的重要因素.(在相似的周期长度和营养条件下，过高OLR会使PHA合成能力丧失).同时证明了氨存在于整个周期对PHA合成菌的富集有积极作用.当氨的浓度较低(只出现在营养丰盛阶段)，饥饿阶段，微生物对除VFA以外有机物的消耗速度较慢，因此需要延长饥饿段时长.当有机负荷较低(6.94×10-7 mol/s)，氨浓度较高(2.5 mol/m3)时，PHA合成菌培养过程较稳定.该系统保持一个较低但持续的PHA含量占细胞干重10%.
Din等[25]描述了一个以发酵POME为底物的系统，其运行周期为6 h，HRT为1 d，pH控制在7.0，温度固定在30 ℃.对微生物群PHA合成所需C/N，C/P进行实验.当180 gSCOD/gP和260 gSCOD/gN时，最高PHA贮存量达到44.5%.
Bengtsson等[28]使用发酵造纸厂废水进行连续实验，系统运行pH为7.3，污泥停留时间为7d，水力停留时间在丰盛和饥饿状态分别为0.2 d和2.2 d.富集得到的生物群主要包括丝状菌和两种形态的菌胶团菌，在苏丹黑或耐尔蓝染色后检测到均能产生PHA，PHA含量平均为细胞干重的11%.ADF过程中以复杂废物作为底物培养的微生物群还未报道出其种类.已确定的合成底物显示出细菌的多样性，由变性梯度凝胶电泳鉴定得到，陶厄氏菌属(Thauera)主要存在于乙酸、丙酸和乳酸混合物浓度不一的反应器中.由RT-PCR和定量FISH分析得到，该属和固氮弓菌属一起在投放醋酸盐的系统中被发现，阿玛瑞球菌则主要存在于投放丙酸盐的系统中.陶厄氏菌属、固氮弓菌属和阿玛瑞球菌贮存PHA的能力得到耐尔蓝染色的确认[29].
Gilda等使用发酵蜜糖废水作为底物驯化混合菌，实验得到以Thauera和Azoarcus为主的菌群.学者认为微生物群落主要受有机负荷影响.当有机负荷为120 mmol/(L·d)，以Thauera为主要菌群，大部分碳用于微生物生长，且影响聚合物的HV含量；当有机负荷为90 Cmmol/(L·d)，以Azoarcus为主要菌群，底物吸收率达到最大.结果显示，最佳的PHA合成菌群需要由大量Azoarcus和少量Thauera组成，以达到更强的PHA合成能力和更佳的聚合物机械性能[30].
然而，已被鉴别出来的物种的相对贮存能力尚未报道.因此，很难评价是否所有物种都具有同等的贮存能力，或者是否有一个物种是贮存PHA的主体.PHA贮存能力和微生物种类的联系使得反应器运行条件的优化设计有利于重要的PHA合成微生物的生长.
2.2 PHA积累许多研究中采用相似的驯化培养，最高的PHA贮存能力仍是基于纯底物.近年，复杂废物才开始用于驯化培养微生物以测试PHA贮存能力.PHA积累效果一方面反映了驯化微生物的PHA贮存能力，另一方面反映了积累过程最优化.Venkata实验设计采用田口方法论，优化研究表明，试验过程微氧环境担当十分重要的角色，随后依次是pH，葡萄糖，磷，氮，铁，VFA组成和VFA含量[31].
在AN/AE过程，通过向反应器提供额外的底物来实现PHA积累.有研究发现，在厌氧条件下，当细胞内糖原达到一定量，PHA开始贮存，而这个过程与外部底物的量无关[32].Dai等发现在厌氧条件下，PHA最高含量达到28%，在好氧条件下，达到41%.在好氧过程中，当VFAs消耗完，一部分糖原会被消耗.Bengtsson等也对厌氧/好氧条件下驯化得到的微生物施加好氧条件.但是，微生物群同时合成糖原和PHA.Bengtsson等对此进行思考，并引入了随后的厌氧步骤，因此好氧段由VAFs合成的糖原会被消耗，VFAs量在新的厌氧条件下达到下一个高峰.
在ADF条件下驯化培养得到的微生物，尽管使用复杂底物进行研究，ADF驯化培养常常产生3HB和3HV的共聚物[26].AN/AE驯化培养则得到第三种单体3HHx或3H2MV.3HB的形成是VFAs和原料以及糖原多样性的直接结果，除此外的单体是由复杂废物培养得到的产物.一般来说，三元共聚物，特别是包含MCL单体表现出更好的力学性能.聚合物组分的稳定性是混合菌利用复杂废物合成PHA的重要方面.由于废水具有周期敏感性和其工艺的变化，这是PHA实现产业化的重点.这个问题可通过人为改变发酵运行参数来解决[24].但是，当原料已经发酵好直接投入系统中，有机酸成分剧烈改变，最终对聚合物组成的控制可能出现问题.
ADF条件下得到的单位COD的混合菌PHA产量，多数情况下，在0.53至0.84之间.更高的实验结果(1.00)由Dionisi得到.同时，Gurieff证明了得到的高产量(0.83和0.84)是其他碳源的功劳而不是VFAs.最低值(0.075和0.14)是使用工业废水[33]和西红柿罐头废水[26]培养得到的.产量的不同可能与原料的组成有关.准确来说，是与上述研究中使用不同VFA组成和浓度有关.贮存量，除了Dionisi的结果，都比Serafim使用醋酸盐(0.87)或用该种底物的PHA理论值(0.84)[34]要低.这种差异是可预料到的，因为发酵的底物含有除了乙酸以外其他可在PHA合成时被脱碳的长链VFA碳源，最终导致单位碳合成较少的PHA.
Moita实验采用的纯生物油里含有丰富的醋酸盐，可用作培养底物来合成短链PHAs.纯生物油和纯醋酸盐作为底物的PHA最大产量占细胞干重比例分别是9.79%和32.47%.虽然纯生物油培养的混合菌表现出较低的PHA合成能力，PHA细胞含量以及PHA总产量都较少.但通过对生物油进行蒸馏或发酵，得到了喜人的成果，分别是16.76%和16.83%.这比其他使用混合菌和复杂底物所得到的PHA产量都要高.此外，Moita预计合理限氮条件，PHA产量能达到更高[35].
AN/AE条件下得到的单位COD的混合菌PHA产量，根据原料和条件，在0.29到0.94之间浮动.除了Coats研究结果以外，PHA产量均低于Dai使用醋酸盐的实验值(0.85).并且，当糖原用作一种内源物质合成PHA时，可以认为AN/AE条件下混合菌的PHA产量比ADF条件下的要高，但是还没有具体结果.
除了Bengtsson以外的学者，在AN/AE条件下，按单位COD计算，混合菌使用实际底物合成PHA量(0.014-0.28)，和Dai使用醋酸盐的实验值范围相似.但是ADF条件下得到的混合菌使用真实复杂底物时无法达到特定产值(0.0082-0.42)，这是使用醋酸盐培养得到的结果(0.72)[36].这个差异可能与底物组成有关.尽管混合菌可达到较高PHA产量，但是仍低于纯菌株的结果，这是因为生物质浓度较低.事实上，有报道提到ADF运行系统中最高细胞浓度为6.1 g/L[37]，这比纯菌株的生物量低很多，纯菌株生物量通常高于80 g/L.Dias等基于用醋酸盐合成PHA的模型，总结出ADF系统中生物质浓度高于10 g/L就足够与纯菌株相比较了.如果驯化的微生物有很强的生长能力和PHA贮存能力，那么提高生物质浓度是有可能的.除了生产力，PHA细胞含量也是一个很重要的参数，用来评价该工艺的效率和可行性.PHA含量直接影响到生产成本：PHA值越低，聚合物提取的成本越高.因此，PHA含量最优化条件由几位学者通过改反应器运行参数得到，如下：底物投放方案，碳氮比，碳磷比，有机负荷，pH，或者温度.合成底物采用分批投放和低浓度氮可得到最高的PHA含量，占细胞干重65%.Dionisi等[37]测试了一系列有机物负荷从9.84×10-8到3.62×10-7 kg/s，得到最大PHA含量为2.31×10-7 kg/s (45.8%).另外，投放原料组成(类型和VFA的量)和多聚物单体组成也在PHA含量中扮演重要角色.由于每个研究中原料组成和总碳源的量都不一样，试图去比较投放不同复杂底物的污泥条件下的PHA含量会有偏差.除了Dionisi使用的工业废水外，所有其他原料都有适用于PHA合成.
3 结论本文对于生物塑料PHA的论述主要包括了厌氧-好氧活性污泥工艺和好氧瞬时供料工艺两大工艺的微生物驯化和PHA积累过程.目前，对于PHA的研究成果主要体现在使用发酵废水提供碳源，用剩余污泥驯化得到具有PHA合成能力的微生物群，优化运行条件(包括COD浓度，碳氮磷比例，碳源类型，磁场强度以及溶解氧)，混合菌在积累过程中可得到较高的PHA含量.而难点主要包括：驯化得到的微生物PHA合成能力不均匀，生物量不足；已被鉴定的菌种其PHA贮存能力无法评价；复杂底物类别和浓度等难以控制；即使通过优化变量，PHA含量仍无法达到使用纯菌种积累的量.
对于PHA的后续研究，应该致力于分离鉴定出更多的合成PHA含量高的微生物，透彻分析不同微生物在PHA驯化积累过程中的作用，达到微生物种类之间的平衡；探索废水中的各种碳源最佳比例，使之得到充分利用；获取可靠微生物和有效碳源以后，再进行条件优化，可最大限度提高微生物PHA含量，减少细胞PHA提取成本，以实现利用混合菌合成PHA的产业化，提高它作为一种环保材料的应用价值.
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