2014, Vol. 31
抗菌肽(Antimicrobial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽[1].此类多肽具有强碱性、热稳定性及广谱抗菌等特点[2].有关研究证明昆虫虽然不具备脊椎动物那样高度特异性免疫体系，但其体内依然具有抵御病原菌侵害的物质[3-4].世界上首次发现抗菌肽的是1980年瑞典科学家H G.Boman等，他们将大肠杆菌及阴沟肠通杆菌注入惜古比天蚕蛹体内，诱导产生具有抗菌活性多肽命名为Cecropins[5].以后数十年间，研究者分别从多种生物体内发现并分离提取到具有活性抗菌多肽[6-7].随着人们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用[8-9]，因此，对此类物质的深入研究将在医药、农业、食品等方面显示出良好的应用价值.
地鳖又名土元，《神农本草经》中既有药用的记载，药用历史已有两千余年，医学实验和长时间的临床实践充分证明地鳖具有活血化瘀、消炎散结、舒经活血、续筋接骨和止痛疗伤等多种药用功效[10].现代药理学研究实验表明，地鳖虫粉及其提取物具有显著破血逐瘀、抗凝血与纤溶蛋白溶解、调节心脏泵功能、调节组织缺氧与抗肿瘤等功效[11-12]，是一种重要的药用昆虫.目前尚未见有对其血淋巴抗菌活性的有关报道.本文采用了活菌注入虫体内诱导产生抗菌肽的方法，研究了诱导地鳖产生抗菌物质的最有效诱导菌、诱导时间，以及加样量、pH、温度和加热时间等因素对其血淋巴抗菌活性的影响等.旨在为地鳖抗菌作用提供实验依据.
1 实验材料及方法 1.1 昆虫及饲养中华真地鳖(Eupolyphage sinensis Walker)成虫(雌性)活体，购自广州市花鸟虫鱼市场，由广东工业大学天然生物活性药物研究室团队鉴定.生长环境：温度26 ℃、相对湿度75%，每日在60 W的白炽灯下光照12 h.幼虫的饲料组分及配比：72%麦麸、20%玉米面、5%豆饼、3%动物性饲料.
1.2 应试菌种大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等均由广东工业大学轻工化工学院生物工程系提供.
1.3 菌液制备分别取无菌条件下培养处于指数生长期(37 ℃培养18～20 h)的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液，用0.9%生理盐水稀释菌液浓度至106个/ml.
1.4 地鳖的诱导随机选取90只地鳖，将其分为3组，每组30只，分别用微量注射器刺穿地鳖体壁将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液注入其体内，每只注入菌液5 μL，处理后将地鳖置于饲料罐中饲养.
1.5 血淋巴收集[13]分别在24、48和72 h收集上述地鳖.将活地鳖用0～4 ℃冷水反复淋洗8～10次，再用无菌双蒸水冲洗3次，滤纸吸干地鳖体表水分，剪去头部收集血淋巴，将其在10 000 r/min离心10 min，取上清液并置冰箱-20 ℃保存备用.
1.6 测定抑菌活力使用平板滤纸片法[14]，圆滤纸片直径小于6 mm.固体平板培养基配制：10 g蛋白胨、3 g牛肉膏、5 g NaCl、20 g琼脂，加双蒸水溶解，定容至1 000 mL，pH值调至6.5，高温灭菌.在直径为7.5 cm的培养皿分别加12 mL无菌培养基制取平板备用.细菌经复苏培养之后, 将对数期的细菌(6×108 个/mL)菌液接种于平板上，每张滤纸片分别加7 μL的血淋巴不同样品，将其以一定间距覆盖在平板上，于37 ℃培养箱中培养24 h后测量抑菌圈直径并记录.
1.7 不同血淋巴量抑菌实验将注入菌48 h后地鳖血淋巴做平板抑菌实验，设4个加样量组，分别为3、5、7、10 μL，每组重复3次，将未经诱导的地鳖血淋巴设置为对照组，37 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径并记录.
1.8 不同pH值血淋巴抑菌实验取适量诱导48 h的地鳖血淋巴分装4小管，分别调其pH为5.0、5.5、6.0和6.5，每组加样7 μL，观察其对大肠杆菌、金黄葡萄球菌的抑菌效果.各组均重复3次，将未经诱导的地鳖血淋巴(pH值分别为5.0、5.5、6.0和6.5)设置为对照组，在37 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径并记录.
1.9 热处理除去杂蛋白与测去杂蛋白血淋巴抑菌效果取3支小管，每管加诱导48 h后血淋巴200 μL，分别用100和80 ℃水浴处理0、0.5、1与2 min后，加100 μL双蒸水混匀，于10 000 r/min离心10 min，取上清液，每组分别吸取7 μL做平板实验，各组均重复3次，将未经诱导的地鳖血淋巴设置为对照组，于37 ℃培养箱中培养24 h后测量抑菌圈直径并记录.
2 结果与分析 2.1 最佳诱导菌种和诱导时间的选定表 1为不同菌种诱导地鳖血淋巴于不同时间的抑菌圈直径，图 1为诱导前后地鳖血淋巴对不同菌种抑制作用比较，图 1的中心滤纸片均为诱导前的血淋巴，周围滤纸片为诱导后的血淋巴.由表 1和图 1可以看出，地鳖诱导前、后的血淋巴均呈现一定程度抑菌圈，说明其具有抑菌活性，抑菌直径越大，抑菌活性越大.经诱导的地鳖血淋巴(周围滤纸片), 其抑菌效果明显高于未诱导的地鳖血淋巴(pH为5.0, 中心滤纸片).其中，经诱导的血淋巴对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最明显(图 1(a)和(b))；经过金黄色葡萄球菌诱导48 h后的血淋巴对3种菌的抑菌圈直径均为最大(图 1(a)、(b)、(c)图中箭头所指)，表明其抑菌活性最高，因此，后面的实验均采取金黄色葡萄球菌诱导48 h后的血淋巴.
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表 1 不同菌种诱导地鳖血淋巴于不同诱导时间的抑菌圈直径 Table 1 Comparison of antibacterial circle diameter of haemolymph from ground beetle induced by different bacteria at different induction time |
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图 1 诱导前、后地鳖血淋巴对不同菌种抑制作用的比较 Figure 1 Comparison of antibacterial effect of Haemolymph from ground beetle inducted and un-inducted by bacteria on different bacteria |
图 2～图 4为血淋巴加样量对不同菌种抑制作用的影响.由图 2～图 4可以看出，当加3 μL样品时，诱导前、后的血淋巴对3种菌的抑制活性几乎没有；而诱导前、后的血淋巴随加样量增加，3种菌株平板中抑菌圈的直径显著增大，说明2种血淋巴对3种菌株的抑制活性随加样量增大而增强；诱导后血淋巴的抑菌作用增强幅度比未经诱导的血淋巴的大.
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图 2 血淋巴加样量对大肠杆菌抑制作用的影响 Figure 2 Relationship between the amount of haemolymph and antibacteial activity to E.coli |
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图 3 血淋巴加样量对金黄色葡萄球菌抑制作用的影响 Figure 3 Relationship between the amount of haemolymph and antibacteial activity to Staphylococcus aureus |
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图 4 血淋巴加样量对枯草芽孢杆菌抑制作用的影响 Figure 4 Relationship between the amount of haemolymph and antibacteial activity to Bacillus subtilis |
图 5为血淋巴pH值对各种抑制活性的影响，由图 5可以看出，随着pH值从5.0到6.5的变化，由金黄色葡萄球菌诱导的血淋巴对3种菌的抑菌活性呈逐渐下降趋势.分别测定诱导前、后地鳖血淋巴的pH值，发现诱导前pH值为7.0，诱导后pH值则为5.0，pH值发生了明显变化.由于昆虫类抗菌肽通常是带正电荷，具有两亲性，为阳离子的多肽[6]，地鳖虫经诱导后体内产生的抗菌肽，使血淋巴天然pH值下降，而其最适pH值是其天然pH值，通常为5.0左右.
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图 5 血淋巴的pH值对各菌种抑制活性的影响 Figure 5 Relationship between the pH value of haemolymph and antibacteial activity respectively to E.coli、Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis respectively |
由图 6可知，诱导前、后的血淋巴经热处理后，对大肠杆菌的抑菌活性均随时间加长而急剧下降.处理温度为80 ℃时，诱导的地鳖血淋巴在处理0.5 min后仍具有一定的抑菌活性，但活性有所下降，抑菌圈直径明显减小，此后其活性变化不大；当处理温度达100 ℃后，诱导地鳖血淋巴其抑菌活性基本丧失.而未经诱导的地鳖血淋巴，经80和100 ℃热处理后均失去抑菌活性.
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图 6 血淋巴的加热温度与时间对大肠杆菌抑制活性的影响 Figure 6 Relationship between the heat temperature of haemolymph at different time and antibacteial activity to E.coli |
由图 7可知，诱导前、后的地鳖血淋巴经热处理后，对金黄色葡萄球菌的抑菌情况与对大肠杆菌的情况相同.地鳖未经诱导或诱导前的血淋巴，经两种不同温度热处理后，抑菌活性均丧失.
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图 7 血淋巴加热温度和时间对金黄葡萄球菌抑制作用的影响 Figure 7 Relationship between the heat temperature of haemolymph at different time and antibacteial activity to Staphylococcus aureus |
枯草芽孢杆菌诱导实验组，经热处理后的诱导前和诱导后地鳖血淋巴抑菌活性都下降了(见图 8).在80 ℃热处理过程中，诱导后地鳖血淋巴经0.5 min热处理，其抑菌圈直径减小显著，而后随着加热时间的延长，其抑菌圈直径随之减小，经过2 min热处理，血淋巴对枯草芽孢杆菌的抑制作用几乎消失；诱导后的地鳖血淋巴经100 ℃热处理后其抑菌作用几乎丧失.地鳖诱导前或未经诱导的血淋巴，经两种热处理后，均失去抑菌作用.
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图 8 血淋巴加热温度与时间对枯草芽孢杆菌抑制活性的影响 Figure 8 Relationship between the heat temperature of haemolymph at different time and antibacteial activity to Bacillus subtilis |
昆虫抵御病原菌入侵的重要措施是产生抗菌肽[9].本文在同一条件下分别将3种菌(大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽胞杆菌)注入3组地鳖体内，诱导其产生抗菌物质，通过收集地鳖血淋巴并进行有关抑菌检测，发现地鳖在受到外源诱导物刺激后其血淋巴的抗菌活性明显增强，而未经诱导的地鳖血淋巴也具有一定的抗菌活性，但其抑菌作用弱于被诱导过的血淋巴, 说明在正常情况下地鳖血淋巴中具有一定量的天然抗菌物质，当受到外源诱导物刺激后其体内的抗菌物质会明显增多，因而抑菌效果显著.经3种诱导菌处理后的地鳖血淋巴虽然对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均具有一定的抑制作用，但可以明显看出抑菌效应有所差异，其中经金黄色葡萄球菌诱导的地鳖血淋巴对3种菌的抑制作用最强，说明抑菌物质的产生量与不同的诱导物有一定关系，且经诱导产生的抗菌物质不具有专一性；经3个诱导时间(24、48、72 h)诱导的地鳖血淋巴中，48h采集的血淋巴抑菌效果最好，说明有效抑菌物质的产生在某一时间达到最高，其原因推测是由于时间过早活性物质尚未形成，而过晚则某些物质失活.这方面的规律尚需要进一步的实验加以揭示.
在进行对诱导后地鳖血淋巴的抑菌实验中，分别对其加样量、pH变化、加热温度和时间的研究，发现加样量的增大其抑菌效果显著增强；pH值为5.0时其抑菌活性的最强；血淋巴的热敏性较强，温度达80和100 ℃处理，其在短时间内失活.
4 结论(1) 地鳖虫经不同的外源菌诱导后，体内产生的抗菌肽比未诱导会明显增多.
(2) 地鳖虫经外源诱导菌诱导产生的抗菌肽的量及抗菌光谱性不同，其中以金黄色葡萄球菌诱导产生的抗菌肽最优.
(3) 地鳖虫经诱导产生的抗菌肽抗菌活性与其用药量正相关，抗菌最适pH为5.0，抗菌肽对热较敏感，超过100 ℃处理，其抗菌活性丧失.
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