肝纤维化(hepatic fibrosis)是因慢性肝损伤而导致的渐进性病理过程，可由肝炎、寄生虫、酒精等因素诱发。研究发现，肝细胞受损后释放多种细胞因子，包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)等，激活肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)后导致胶原蛋白等细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成与沉积，造成肝纤维化。因此，HSC是肝纤维化形成的细胞学基础，也是治疗的核心靶点之一[1-2]。
阻止肝纤维化是防治肝硬化和肝癌的重要措施[3]，但由于目前尚无有效的临床药物，所以抗肝纤维化药物的研发受到了广泛关注[4-5]。中药柴胡指伞形科植物柴胡(又名北柴胡，Bupleurum chinense DC.)或狭叶柴胡(又名南柴胡，Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根。以柴胡为君药的小柴胡汤被广泛用于多种肝病的临床治疗，如病毒性肝炎、肝纤维化和肝癌等[6-8]。Shimizu[9]证明小柴胡汤可减轻氧化应激和抑制HSC增殖，从而抑制肝纤维化发生。柴胡皂苷d(saikosaponin d，SSd)是柴胡的主要活性成份之一[10-11]，可通过诱导凋亡和自噬作用抑制癌细胞的增殖[12-14]。李素婷等[15]报道SSd通过降低α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)含量，抑制HSC活化和酒精性肝纤维化发生；沈艳婷等[16]认为SSd通过雌激素受体β(ERβ)抑制转录激活蛋白-1(AP-1)和核因子NF-κB的表达而抑制HSC活化。本研究以TGF-β1诱导活化的大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)为纤维化细胞模型，通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和流式细胞法等技术分析SSd对该细胞模型的作用效果，从而为中药柴胡的现代化应用提供支持。
1 实验部分 1.1 实验原料和仪器大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自中国医学科学院肿瘤医院。
SSd(CAS：20874-52-6)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(纯度≥98%)；TGF-β1购自英国Abcam公司；CCK-8细胞增殖试剂盒、总蛋白含量检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；FastKing RT反转录试剂盒(含gDNase)、培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Fast SYBR Green Master Mix试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒购自美国Promega公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
Rotor-GeneQ qRT-PCR仪，德国Qiagen公司；MoFlo XDP高速流式细胞分选仪，美国Beckman Coulter公司；EnSpire多功能酶标仪，美国PerkinElmer公司；DL-CJ-2ND超净台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；Forma 3110二氧化碳培养箱，美国Thermo Fisher公司。
1.2 实验方法 1.2.1 SSd母液制备称取1 mg SSd溶解于20 μL二甲基亚砜(DMSO)，加入980 μL磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)混匀后备用。
1.2.2 HSC-T6培养、活化与增殖率检测细胞培养：使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5% CO2贴壁培养，每48 h更换培养基。细胞铺满培养皿底80%后使用0.25%胰酶消化传代。后续实验选择对数生长期细胞。
HSC-T6细胞以5 000个/孔接种于96孔板。TGF-β1溶于10 mmol/L柠檬酸(pH=3.0)配制成50 μg/mL母液。细胞培养24 h后去除培养基，用PBS清洗后换用无血清培养基。对照组不加药物，实验组加入TGF-β1或SSd+TGF-β1培养24 h。更换培养基，每孔加入100 μL CCK-8试剂，继续培养2 h后用酶标仪在450 nm波长下测得各复孔光密度值(OD)。通过式(1)计算细胞增殖率(PR)。
| $ PR = (O{D_{\rm{E}}} - O{D_{\rm{C}}})/O{D_{\rm{C}}} \times 100\% $ | (1) |
式中，ODE为实验组OD450均值，ODC为对照组OD450均值。
1.2.3 细胞凋亡分析细胞培养24 h后去除培养基，用PBS清洗后加入无血清培养基和TGF-β1或SSd+TGF-β1继续培养24 h。胰酶消化，800 r/min离心10 min，收集细胞。用预冷的PBS洗涤细胞3次，Binding Buffer洗涤1次。用Binding Buffer重悬细胞至1×106个/mL。取100 μL细胞悬液加入5 μL Annexin V-FITC混匀，室温避光孵育10 min。加入5 μL PI，室温避光孵育5 min后加入390 μL PBS混匀。用流式细胞仪检测，并使用Summit 5.2软件统计和分析数据。
1.2.4 qRT-PCR测定基因转录水平分离纯化细胞总RNA，经体外一步法反转录为cDNA。使用SYBR Green为荧光标记，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)或原癌基因abl-1为内参。每个样品设置3个重复。结果用2-ΔΔCT值法分析mRNA相对含量，并以对照组为1。qRT-PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，序列如表 1所示。
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下载CSV 表 1 qRT-PCR引物 Table 1 qRT-PCR primers |
使用Graphpad Prism 6软件进行数据分析与绘图，结果表示为x±SE。组间差异分析使用t检验：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001；n.s.，P>0.05，无显著性差异。重复数N≥3。
2 结果与讨论 2.1 SSd抑制活化HSC增殖TGF-β1是常用的促纤维化细胞因子，可以诱导HSC-T6细胞活化，表现为细胞增殖与纤维化相关基因表达[17]。为确定本研究中TGF-β1诱导建模的最优浓度，分别使用终质量浓度为2、5 ng/mL和10 ng/mL的TGF-β1处理细胞24 h，使用CCK-8染色法测定增殖率。图 1结果显示，TGF-β1浓度与HSC-T6增殖率呈正相关，且于5 ng/mL开始显著提高细胞增殖率(图 1，11.9%；图 2，11.8%)。
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图 1 TGF-β1诱导HSC-T6增殖 Fig.1 TGF-β1 stimulates the proliferation of HSC-T6 |
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图 2 SSd抑制活化HSC-T6的增殖 Fig.2 SSd inhibits the proliferation of activated HSC-T6 |
将SSd母液稀释至终浓度为5、10 μg/mL和20 μg/mL，分别与5 ng/mL TGF-β1联合处理细胞。经24 h测定细胞增殖率如图 2，发现5 μg/mL SSd显著抑制了HSC-T6增殖(PR=-40.3%)。而10 μg/mL和20 μg/mL SSd浓度组的细胞死亡率分别达到88.4%和92.7%，证明高浓度SSd对HSC具有细胞毒性。由于文献报道中SSd作用于HSC的最优浓度及半数抑制浓度(IC50)均为4 μg/mL左右[18-20]，所以本研究选择5 μg/mL SSd与5 ng/mL TGF-β1联合开展后续实验。
2.2 SSd抑制纤维化相关基因转录使用TGF-β1诱导HSC-T6 24 h后，采用qRT-PCR对胞内TGF-β1、PDGF、α-SMA和Col-III4种纤维化相关基因的mRNA含量进行测定。其中有丝分裂原PDGF能够促进活化HSC增殖分裂[21]；α-SMA是HSC活化的主要标志；而Col-Ⅲ是肝纤维化ECM的主要成份之一。结果显示，与空白对照相比4种mRNA含量均有不同程度的上升，证明细胞活化程度增加(图 3)。并且TGF-β1诱导HSC-T6活化可能存在正反馈调节现象，即活化后的细胞会进一步增加TGF-β1的表达。与TGF-β1单独处理相比，SSd+TGF-β1处理显著降低TGF-β1、PDGF和α-SMA的mRNA含量，说明SSd具有抑制HSC-T6活化的作用。但是由于SSd不影响Col-III的mRNA含量，所以推测SSd不抑制ECM生成。
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图 3 SSd抑制活化HSC-T6的纤维化相关基因转录 Fig.3 SSd inhibits the transcription of the fibrosis related genes of activated HSC-T6 |
使用TGF-β1或SSd+TGF-β1处理HSC-T6，24 h后采用流式细胞技术分析细胞凋亡情况。结果如图 4所示，SSd能够显著增加早期凋亡的细胞比率(Q4)，而单独TGF-β1处理则增加细胞坏死比率(Q2)。两种处理条件下晚期凋亡细胞(Q1)所占比例差别不显著。
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图 4 SSd诱导活化HSC-T6凋亡 Fig.4 SSd induces apoptosis of activated HSC-T6 |
为探究SSd诱导HSC-T6凋亡的分子机制，使用qRT-PCR检测胞内bad、bax和cas-3 3种促凋亡基因的mRNA水平。尽管SSd+TGF-β1处理组与空白对照组没有统计学差异(图 5，P>0.05)，但是SSd仍然表现出增强促凋亡基因转录的趋势。结合流式细胞分析数据，上述结果表明SSd通过激活cas-3凋亡信号通路诱导HSC发生凋亡。
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图 5 SSd上调促凋亡基因转录水平 Fig.5 SSd up-regulates the transcription of proapoptotic genes |
线粒体功能异常是导致细胞凋亡的重要原因[22]，有文献报道SSd能够影响线粒体正常功能并引发HSC凋亡[23]。使用CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒测定胞内ATP相对含量(将ATP含量与蛋白质浓度的比值进行归一化)分析线粒体状态，结果显示，TGF-β1单独处理不影响ATP相对含量，但SSd+TGF-β1共同处理显著降低了ATP浓度(图 6)。因此，SSd可能会抑制线粒体的能量代谢，这是诱导HSC凋亡的另一原因。
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图 6 SSd下调活化HSC-T6胞内ATP含量 Fig.6 SSd down-regulates the ATP level in activated HSC-T6 |
综上所述，5 μg/mL SSd能够抑制HSC-T6活化增殖和纤维化相关基因的转录，并且诱导细胞发生凋亡。SSd的作用性质同在研的抗肝纤维化药物相一致，如广谱抗纤维化药物吡非尼酮(pirfenidone)可以降低TGF-β1表达[24]；恩利卡生(emricasan)可以抑制caspase活性和HSC活化[25]。在四氯化碳(CCl4)诱导建立的肝纤维化大鼠模型中，多种实验方案均能够抑制HSC活化增殖或诱导活化HSC凋亡[26-28]，其中聚乙二醇化肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(PEGylated TRAIL)治疗能够抑制α-SMA表达；针灸联合姜黄素能有效抑制PDGF产生。由此可见，SSd具有治疗肝纤维化的潜在临床价值。需要注意的是高浓度SSd对HSC具有明显的细胞毒性，因此要对药物安全性进行充分评估。
3 结论柴胡皂苷d(SSd)在体外可以抑制HSC活化和增殖，降低纤维化相关基因的转录水平。同时SSd能够诱导活化HSC发生凋亡，其可能的机制包括激活cas-3介导的凋亡通路和影响线粒体能量代谢两条途径。因此，基于SSd对HSC的作用效果开发抗肝纤维化药物具有较大的潜力。本研究为中药柴胡的现代化应用提供了支持。
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