水痘-带状疱疹病毒（VZV）是一种具有高度传染性的α疱疹病毒和基因组为双链DNA的病毒，人是其唯一的自然宿主^[1]。病毒感染可引起两种不同的疾病，即水痘和带状疱疹。原发感染表现为水痘，为儿童常见疾病。原发感染后，病毒能够潜伏在感觉神经节内的神经细胞中，当机体免疫功能低下或者年老体弱时被重新激活发生带状疱疹。VZV仅有一种血清型且基因组相对保守^[2]，但不同型别的VZV在特定单核苷酸多态性（SNP）位点上仍有较大的差异^[3]。因此，基于SNP不同位点的碱基差异可对VZV进行基因分型，在VZV流行病学研究和疫苗研发等方面具有重要意义。近年来宜昌市带状疱疹报告发病率为5.82/1 000人年，其中≤20岁人群报告发病率为1.02/1 000人年。且研究表明近年来儿童青少年带状疱疹的发病率呈上升趋势^[4-5]，应做好带状疱疹的监测工作。本研究分析2019-2020年宜昌市≤20岁人群中带状疱疹患者的VZV流行株基因特征，补充我国带状疱疹患者的VZV基因型别数据库。

对象与方法

1. 研究对象：2019年3月至2020年9月被临床诊断为带状疱疹的病例，年龄≤20岁、签署知情同意书、病史资料完整者。根据宜昌市健康管理大数据平台，选择带状疱疹病例集中和就诊量位居前3位（占比超过85%）的医院为研究现场，3家医院分别是宜昌市中心人民医院、宜昌市第一人民医院和宜昌市第二人民医院。带状疱疹的临床诊断标准采用WHO统一制定的国际疾病分类第10次修订本（ICD-10）中包含“B02”编码的带状疱疹。本研究已通过中国CDC伦理审查委员会审批（批准文号：201833）。

2. 研究方法：

（1）标本采集与运送：采集病例的疱疹液和咽拭子，按照标本冷藏和冷链要求储存和转运至中国CDC病毒病预防控制所。

（2）实时荧光定量PCR检测：采用商品化VZV核酸检测试剂盒[巨吉众合（北京）生物科技有限公司]和CFX96 TouchDeepWell实时荧光定量PCR仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]对46份标本进行VZV核酸检测，具体操作按说明书进行，阳性表明检出VZV。

（3）病毒分离：选择人二倍体细胞（MRC-5）进行细胞培养，细胞状态良好时进行病毒接种，并设置细胞阳性对照和阴性对照，37 ℃孵育每日观察并记录细胞病变（CPE），CPE达到细胞单层的75%~100%时收获、冻存病毒。

（4）核酸提取：采用病毒DNA提取试剂盒（西安天隆科技有限公司）和GeneRotex96核酸提取仪（西安天隆科技有限公司）提取DNA，具体操作按说明书进行，置-20 ℃低温保存待用。

（5）基因型别鉴定：应用PCR仪（Applied Biosystems ProFlex^TM，Thermo公司）进行VZV核酸片段扩增，引物使用特异性靶标片段开放阅读框（ORF）22和ORF38，Sanger序列测定，5+1SNP法（37902、38019、38055、38081、38177和69424）鉴定阳性疱疹液和咽拭子标本的基因型别。PCR扩增的反应条件为95 ℃ 2 min；95 ℃ 45 s，45 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

（6）系统进化树分析：从美国国立生物技术信息中心（NCBI）核苷酸数据库中下载各型别VZV参考株序列，利用Snapgene将VZV阳性样本测序结果与目前公认的参考株进行多序列比对，Dumas株作为参考基因组序列。利用Dnastar 7.1软件进行序列同源性分析。MEGA 7软件依托比对好的ORF22核苷酸序列构建系统发育进化树，在Phylogeny选项中选择邻接法（neighbor-joining method，NJ法），替代模型选择Kimura-2-parameter model，其中Bootstrap值选择1 000次。

3. 质量控制：由经过统一专业培训的人员开展现场流行病学调查，标本采集后储存在2~8 ℃冰箱，并在采样后48 h内进行转运。病例疱疹液标本采集率达95.65%，咽拭子标本采集率达89.13%。

结果

1. 基本情况：46例带状疱疹患者中，男女性别比为1.3∶1（26∶20），年龄范围7~20岁；病程（20.5±12.0）d。就诊后采样时间范围0~3 d，就诊当天和第3天采样分别为44和2例。仅有15例有水痘疫苗接种史，其中接种1和2剂次分别为13例和2例，接种4周内均未发生水痘样皮疹。

2. VZV阳性和基因型别：46例带状疱疹患者中，VZV阳性率为73.91%（34/46）。SNP分析结果显示，34株VZV基因型别均为Clade 2遗传支，其中接种过和未接种过水痘疫苗的分别为10例（29.41%）和24例（70.59%）。其中，有两份标本2019-YC-22-F04和2019-YC-22-B13分别在108009和106092位点发生A→G突变，另有两份标本2019-YC-22-B04和2019-YC-22-B22均在69361位点发生C→T突变。见表 1。

3. 系统进化分析：34株VZV的ORF22片段序列与NCBI上参考株的对应序列进行聚类分析结果显示，核苷酸关系树分为5个分支。34株与VarilRix、VariVax、Baike、pOka和vOka均在同一分支上，且34株标本与Clade 2代表株核苷酸对比显示序列匹配度为99.0%~100.0%，进一步证明本研究标本序列与Clade 2序列为同属。见图 1。

讨论

VZV基因组约由125 000个碱基对组成，有74个ORF，至少可以编码71种病毒基因产物^[6]，根据SNP位点可将其划分为不同的基因型。2017年通过对VZV全基因组序列的比较分析，将VZV划分为8个基因型：7个已确立的基因型（Clade 1、Clade 2、Clade 3、Clade 4、Clade 5、Clade 6和Clade 9）及1个临时基因型Clade Ⅷ。新分型方案在2008年分型方案的基础上^[7]，结合了Sanger测序与二代测序技术，提高了VZV基因组测序的效率和完整性^[8]。VZV在全球范围内均有传播，其基因型显示出独特的地理分布。其中Clade 1主要分布在俄罗斯及部分温带国家或地区，以Dumas株为代表；Clade 2主要分布在我国和蒙古国等亚洲国家，以pOka、vOka株为代表；Clade 3主要分布在欧美地区，以HJ0、03-500株为代表；Clade 4以8、M2DR株为代表，Clade 5以CA123株为代表，主要分布在非洲和赤道附近的热带、亚热带地区^[9]。

本研究分析ORF22和ORF38核苷酸序列判断VZV基因型别，2019-2020年宜昌市VZV基因型别均为Clade 2，既往文献对吉林省、辽宁省、四川省、山东省、北京市和西安市研究发现VZV均以Clade 2为主^[10-13]，说明与我国流行的VZV基因型一致。宜昌市位于湖北省西南部，VZV基因型较单一，符合其地理分布特点。根据VZV基因分型新方案，确定宜昌市VZV基因型及基因特征，有助于掌握VZV分子流行病学特征，为VZV感染的防控提供实验室依据。

目前我国对VZV基因特征分析中，研究对象多为水痘患者，较少选用带状疱疹患者^[14-15]。带状疱疹的发病率随着年龄的增长而升高，多见中老年，儿童青少年罕见，但近年来儿童带状疱疹的发病率呈上升趋势^[4-5]。

本研究存在局限性。一是医院因新型冠状病毒感染疫情停诊3个月造成病例收集和标本采集遇到困难；二是低年龄人群带状疱疹的发病率较低且样本量不足。

综上所述，2019-2020年宜昌市≤20岁人群带状疱疹的VZV主要流行株型别为Clade 2遗传支。需进一步开展后续研究，建立我国较为全面的VZV基因数据库。本研究基于宜昌市健康管理大数据平台，及时发现和采集≤20岁带状疱疹病例标本，依托中国CDC病毒病预防控制所对VZV基因型进行鉴定，丰富了我国≤20岁人群带状疱疹VZV基因数据库，为低年龄人群的带状疱疹防控工作提供参考依据。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  尤美莹、王苗苗：论文撰写、论文修改、数据分析及解释；郭宏、王天奇：数据收集与整理、参与实验实施；李旭东：英文校对、审阅文章；许松涛：研究设计、论文修改、实验指导；胡跃华、殷大鹏：设计实验、审阅文章、经费支持