文章信息
- 刘晓田, 屠润琪, 何亚玲, 董小康, 李瑞颖, 侯建, 李玉倩, 王重建.
- Liu Xiaotian, Tu Runqi, He Yaling, Dong Xiaokang, Li Ruiying, Hou Jian, Li Yuqian, Wang Chongjian
- JAK2基因甲基化与肥胖因果关联的孟德尔随机化研究
- Mendelian randomization analysis: the causal relationship between the DNA methylation levels of JAK2 and obesity
- 中华流行病学杂志, 2022, 43(8): 1315-1320
- Chinese Journal of Epidemiology, 2022, 43(8): 1315-1320
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112338-20220318-00200
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文章历史
收稿日期: 2022-03-18
肥胖是一种由多因素共同引起的能量代谢紊乱性相关疾病,已成为心脑血管疾病发生的重要危险因素,特别是由于内脏脂肪堆积导致的腹型肥胖,但其发生机制尚不完全清楚[1-3]。研究表明,酪氨酸激酶2(Janus kinase,JAK2)在能量代谢异常所致肥胖的发生发展中起到重要调控作用[4-6],但相关研究主要集中在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)上[7],而SNP等位基因仅能解释部分肥胖的遗传易感性。近年研究揭示DNA甲基化的表观遗传在肥胖易感性中扮演着重要角色[8-9]。不同区域甲基化的水平对基因的影响不同,当甲基化发生在启动子区时,会使基因的表达沉默,而发生在基因体(尤其是外显子区)时能够激活基因的表达[10-11]。内脏脂肪指数可用于评价内脏脂肪型肥胖[12-13]。尽管有研究指出基因的甲基化水平与肥胖存在关联[14],但关于JAK2基因甲基化水平与内脏脂肪型肥胖的关联尚不清楚。孟德尔随机化法是利用工具变量来推断暴露因素和研究结局之间的因果关联[15]。本研究拟采用病例对照研究设计,以SNP为工具变量,利用孟德尔随机化法分析JAK2基因甲基化水平与肥胖的关联,以期为肥胖的发生发展的分子机制提供理论依据。
对象与方法1. 研究对象:从河南农村队列(注册号:ChiCTR-OOC-15006699)中选取1 021例研究对象[16],其中肥胖者440例,对照者581例。本研究通过郑州大学生命科学伦理委员会审查[批准文号:[2015]MEC(S128)],所有研究对象均签署了知情同意书。
2. 调查内容:由经过统一培训的调查员收集研究对象的相关资料。主要包括:①问卷调查:一般人口学特征(性别、年龄、婚姻状况等)、社会经济状况(文化程度、人均月收入等)、生活习惯(吸烟、饮酒、体力活动、水果蔬菜摄入、高脂饮食等)。吸烟定义为每天至少吸1支烟并持续6个月及以上,分为从未吸烟、戒烟和现在吸烟3个变量。饮酒定义为过去一年中饮酒至少12次以上(包括白酒、啤酒、红酒或黄酒等种类),分为从未饮酒、戒酒和现在饮酒3个变量。参照《中国居民膳食指南(2016)》简介,过去一年中,平均每天摄入的畜肉和禽肉总量≥75 g即为高脂饮食,平均每天摄入的蔬菜和水果总量≥500 g即为较多蔬菜水果摄入[17]。基于问卷调查的3类体力活动(剧烈体力活动、适度体力活动和步行活动)的频次和时间,分别计算3类体力活动的每周代谢当量(metabolic rate,MET)值;最后依据国际体力活动量表,将体力活动分为轻、中和重度3个等级[18]。②体格检查:根据操作指南采用日本欧姆龙HBF-371体脂仪测量内脏脂肪指数。③血液样本采集:空腹至少8 h后,由专业医护人员采集研究对象肘静脉血10 ml于乙二胺四乙酸二钾抗凝采血管,分别收集全血、血浆和白细胞于1.5 ml的EP管中,编号记录,并保存于-80 ℃冰箱中,用于生化指标检测和DNA的提取。
3. DNA提取:利用全血基因组DNA提取试剂盒Ⅲ(北京百泰克生物技术有限公司)对储存于-80 ℃的血样经水溶解冻后提取全血DNA。为保证SNP分型和甲基化检测结果的可靠性,要求待测样本的DNA浓度在50 ng/μl左右(不低于20 ng/μl),A260/A280在1.7~2.0之间,且凝胶电泳实验显示DNA无明显降解。
4. JAK2基因SNP位点的选择:①生物信息学方法:从HapMap数据库下载中国汉族人群的JAK2基因信息,应用Haploview 4.2软件,以SNP连锁不平衡r2 > 0.8和MAF > 0.05为标准,选择标签SNP(12个)。或②查阅文献,筛选出文献报道的可能与肥胖相关的JAK2基因SNP位点(8个)。且③选择与JAK2基因甲基化水平相关的SNP(P < 0.05)作为工具变量候选集(5个)。结合上述筛选标准,最终本研究共纳入JAK2基因的5个SNP位点(rs2149556、rs2230724、rs3780378、rs7847294和rs7849191)。
5. 基因型检测:采用SNPscan®技术对提取的DNA样本进行SNP基因分型,取4.0 μl样本经过裂解、连接反应和多重荧光PCR反应后,利用ABI3730XL进行测序,获得基因各位点的基因型。
6. 甲基化水平检测:在GenBank中查找JAK2基因序列,并扩大5 000 bp,基于欧洲生物信息研究所的数据库(EMBL-EBI,https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/),查询JAK2基因启动子区和外显子区上的CpG岛(观察/预期比率 > 0.60,C%+G% > 50.00%,长度 > 200 bp),得到3个CpG片段(包含63个CpG位点):片段252(4984509~4984760)和片段441(4984775~4985215)位于启动子区,片段218(4985238~4985455)位于外显子区。每个CpG片段设计一对引物进行检测,利用MethylTargetTM目标区域甲基化测序技术(中国上海天昊生物有限公司)对JAK2基因的DNA甲基化水平检测,在引物和PCR条件优化的基础上,取2.0 μl样本,经过重亚硫酸盐处理,通过多重PCR添加特异性标签,定量后最终采用Illumina Hiseq/Miseq进行高通量测序。然后与参考序列比对,得到甲基化位点DNA甲基化水平。
7. 肥胖定义:根据日本欧姆龙HBF-371体脂仪操作指南,内脏脂肪指数≥10定义为肥胖组,内脏脂肪指数 < 10定义为对照组[12]。
8. 质量控制:现场调查阶段:采用标准化问卷,并进行预调查对问卷进行评估。在正式调查前对所有参与的调查人员进行统一培训,考核合格后方可参加现场调查,确保调查规范执行。在调查期间,对已完成的问卷进行审核,确保问卷的完整性。实验室检测阶段:采集血样后,迅速进行离心和分装,并全程进行冷链运输。并随机抽取3%的样本进行复测,确保结果的可信性。数据录入阶段,对调查问卷进行一致性检验和逻辑纠错,以确保问卷信息的正确性和完整性。
9. 统计学分析:对JAK2基因3个片段上63个CpG位点甲基化水平与肥胖易感性的关联进行初步的单因素条件logistic回归分析,共发现6个CpG位点(Chr9:4984943、Chr9:4985378、Chr9:4985404、Chr9:4985407、Chr9:4985409和Chr9:4985435)甲基化水平与肥胖相关(P < 0.05),随后对6个CpG位点甲基化水平与肥胖的关联进行分析。通过EpiData软件建立数据库,并对问卷进行双人双机双录入。连续变量报告x±s,分类变量报告人数(百分比)。采用t检验或χ2检验比较一般人口学特征、社会经济状况和生活习惯在肥胖和非肥胖组间差异。采用多因素logistic回归模型分析JAK2基因DNA甲基化水平和SNP基因型与肥胖的关联,用OR值及其95%CI表示,调整因素包括年龄、性别、文化程度、婚姻状况、人均月收入、肉类及蔬菜水果摄入和体力活动等。
采用孟德尔随机化法探讨DNA甲基化水平与肥胖之间的因果关联,具体步骤见图 1。首先分析SNP位点与CpG甲基化位点及肥胖的关联,确认工具变量选取的合理性:采用Hardy-Weinberg平衡检验5个SNP位点之间独立性,以排除工具变量之间的强共线性对模型的影响;采用Spearman秩相关和单因素logistic回归分析5个SNP位点与JAK2基因甲基化水平相关性;采用Egger回归孟德尔随机化法(Mendelian randomization-Egger method,MR-Egger)的截距检验工具变量是否具有水平多效性[19]。然后,以SNP为工具变量,分别应用逆方差加权孟德尔随机化法(Mendelian randomization method of inverse variance weighted,MR-IVW)、基于中位数孟德尔随机化法(Mendelian randomization method of median based,MR-Median)和最大似然比法(Maximum-likelihood method)对JAK2基因甲基化水平与肥胖之间的因果关联进行评估。以上分析全部在R 4.0.0软件中进行,检验水准α=0.05。
结果1. 一般人口学特征:共纳入研究对象1 021例,其中肥胖组人数为440例,对照组人数为581例。年龄为(59.5±8.6)岁,其中肥胖组(60.0±8.3)岁,对照组(59.1±8.8)岁,肥胖组和对照组的年龄差异无统计学意义(P=0.122)。男性443例,女性578例,性别在肥胖组和对照组的分布差异有统计学意义(P < 0.001)。对照组不吸烟和不饮酒的比例高于肥胖组,差异有统计学意义(P < 0.05)。文化程度、婚姻状况、人均月收入、高脂饮食、较多蔬菜水果摄入以及体力活动在肥胖组和对照组的分布差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 1。
2. JAK2基因甲基化水平与肥胖关联分析:本研究在启动子区发现1个甲基化位点(Chr9:4984943)与肥胖呈正相关,其OR值(95%CI)为1.22(1.04~1.42)。在外显子区,共发现5个甲基化位点(Chr9:4985378、Chr9:4985404、Chr9:4985407、Chr9:4985409和Chr9:4985435)与肥胖呈负相关,OR值(95%CI)分别为0.53(0.29~0.95)、0.58(0.36~0.93)、0.69(0.49~0.97)、0.72(0.53~0.99)和0.58(0.35~0.98)。见表 2。
3. JAK2基因SNP与肥胖的关联分析:对于rs2149556和rs3780378位点,与野生纯合子CC基因型相比,突变杂合子CT基因型与肥胖呈负相关,OR值(95%CI)分别为0.67(0.49~0.91)和0.68(0.49~0.94)。见表 3。
4. 孟德尔随机化分析:Hardy-Weinberg平衡分析显示5个SNP位点之间的r2均 < 0.8,说明5个SNP位点之间连锁不平衡,相互独立。Spearman秩相关和单因素logistic回归分析结果显示,6个SNP位点与JAK2基因甲基化水平相关(P < 0.05)。MR-Egger回归截距的结果显示,JAK2基因甲基化与肥胖之间的相关性无方向性多效性(MR-Egger截距=-0.002,P=0.952)。
以JAK2基因5个SNP位点作为工具变量,通过孟德尔随机化法对JAK2基因甲基化水平与肥胖的关联进行因果推断。3种孟德尔随机化方法(MR-IVW,MR-Median和Maximum-likelihood method)的结果均显示JAK2基因甲基化水平与肥胖存在因果关联,差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 4。
讨论本研究以SNP为工具变量,通过孟德尔随机化法探讨JAK2基因甲基化水平与肥胖之间的关联,结果显示JAK2基因启动子区1个甲基化位点(Chr9:4984943)与肥胖呈正相关,外显子区5个甲基化位点(Chr9:4985378、Chr9:4985404、Chr9:4985407、Chr9:4985409和Chr9:4985435)水平与肥胖呈负相关,提示JAK2基因甲基化水平可能与肥胖的发生相关。多数环境因素并不足以引起基因突变,但基因DNA甲基化水平易受环境因素的影响,因此,本研究进一步以JAK2基因SNP位点为工具变量,通过孟德尔随机化法发现JAK2基因高甲基化可抑制肥胖的发生。
基因的SNP位点的基因型在出生时就已经确定,并且不受外界环境和行为因素的干扰而改变,因此,在孟德尔随机化法中,基因的SNP位点被认为是天然的工具变量。本研究选取JAK2基因的5个SNP位点作为工具变量,显示JAK2基因甲基化水平和肥胖存在的因果关联。来自加纳的一项肥胖全血表观遗传学研究发现,基因甲基化水平与肥胖存在关联[20]。而另一项新生儿队列研究也发现,生命早期肥胖相关基因甲基化的水平与儿童早期肥胖有关[21],同时也提示了甲基化水平的改变与健康效应存在一定的因果关联。中国双生子队列研究也证实,基因甲基化水平的改变能够影响肥胖的发生[14],与本研究结果一致。在本研究中JAK2是能量代谢通路JAK/信号转导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)的重要基因。当细胞因子和相应的受体结合之后,诱导JAK2发生磷酸化,磷酸化的JAK2具有生物活性,进一步促进下游的STAT家族的分子发生磷酸化并转移至细胞核与DNA相结合激活下游的靶基因,产生生物学作用(降低饥饿感来减少食物摄入,并增加能量消耗)[22-23]。
本研究发现1个启动子区甲基化位点与肥胖呈正相关,而5个JAK2的外显子区的甲基化位点与肥胖呈负相关。有研究表明,启动子区的甲基化会使基因发生沉默,而基因体发生甲基化会刺激基因的表达[11],这与本研究结果一致。JAK2可被许多关键的Ⅰ类细胞因子受体用于信号转导,如生长激素、红细胞生成素、白细胞介素-3、白细胞介素-6、干扰素-γ和瘦素[24]。当基因的启动子区发生甲基化时,会使启动子区的序列改变,从而使基因的表达沉默[11]。最近一项研究已经证实,基因外显子区的甲基化水平升高时,能通过选择性剪切来提高基因的转录水平,进一步促进基因的表达[10]。因此JAK2基因的启动子区甲基化水平升高可能抑制JAK2蛋白的表达,而外显子区甲基化水平的升高可能促进JAK2蛋白的表达,进而影响JAK/STAT通路的活性,从而改变肥胖的发生发展。
本研究存在局限性。第一,林丽娟等[25]的研究发现,运用孟德尔随机化法评估暴露因素与疾病结局因果关联时,其检验效能受工具变量SNP与甲基化水平的关联强度的影响。本研究结果发现JAK2基因5个SNP位点与甲基化水平相关强度较弱,可能会造成结果的偏差。但是,3种孟德尔随机化法结果均显示JAK2基因高甲基化可降低肥胖的发生风险,在一定程度上反映了本研究结果的可信性。第二,本研究样本量有限,也可能影响结果的稳定性[26]。第三,由于本研究对象为农村人群,研究结果推广到其他人群时需要谨慎。在后续研究中,继续增加样本量,并动态检测JAK2基因的甲基化水平,以便能更可靠地推断JAK2基因甲基化水平与肥胖的关联。
临床试验注册:中国临床试验注册中心,ChiCTR-OOC-15006699
Trial registration: Chinese Clinical Trial Registry, ChiCTR-OOC-15006699
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 刘晓田:实验操作、数据整理、统计学分析、论文撰写及修改;屠润琪、何亚玲:论文撰写、数据整理及统计学分析;董小康、李瑞颖、侯建、李玉倩:实验操作、论文修改;王重建:研究指导、经费支持
[1] |
NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Trends in adult body-mass index in 200 countries from 1975 to 2014: a pooled analysis of 1698 population-based measurement studies with 19·2 million participants[J]. Lancet, 2016, 387(10026): 1377-1396. DOI:10.1016/S0140-6736(16)30054-X |
[2] |
Flegal KM, Kit BK, Orpana H, et al. Association of all-cause mortality with overweight and obesity using standard body mass index categories: a systematic review and meta-analysis[J]. JAMA, 2013, 309(1): 71-82. DOI:10.1001/jama.2012.113905 |
[3] |
Kuk JL, Katzmarzyk PT, Nichaman MZ, et al. Visceral fat is an independent predictor of all-cause mortality in men[J]. Obesity (Silver Spring), 2006, 14(2): 336-341. DOI:10.1038/oby.2006.43 |
[4] |
Zhang C, Liu J, Yuan CQ, et al. JAK2/STAT3 is associated with the inflammatory process in periapical granuloma[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2019, 12(1): 190-197. |
[5] |
Chen YN, Lu W, Jin ZY, et al. Carbenoxolone ameliorates hepatic lipid metabolism and inflammation in obese mice induced by high fat diet via regulating the JAK2/STAT3 signaling pathway[J]. Int Immunopharmacol, 2019, 74: 105498. DOI:10.1016/j.intimp.2019.03.011 |
[6] |
Gurzov EN, Stanley WJ, Pappas EG, et al. The JAK/STAT pathway in obesity and diabetes[J]. FEBS J, 2016, 283(16): 3002-3015. DOI:10.1111/febs.13709 |
[7] |
Ge DL, Gooljar SB, Kyriakou T, et al. Association of common JAK2 variants with body fat, insulin sensitivity and lipid profile[J]. Obesity (Silver Spring), 2008, 16(2): 492-496. DOI:10.1038/oby.2007.79 |
[8] |
Pant R, Firmal P, Shah VK, et al. Epigenetic regulation of adipogenesis in development of metabolic syndrome[J]. Front Cell Dev Biol, 2021, 8: 619888. DOI:10.3389/fcell.2020.619888 |
[9] |
Ling C, Rönn T. Epigenetics in human obesity and type 2 diabetes[J]. Cell Metab, 2019, 29(5): 1028-1044. DOI:10.1016/j.cmet.2019.03.009 |
[10] |
Shayevitch R, Askayo D, Keydar I, et al. The importance of DNA methylation of exons on alternative splicing[J]. RNA, 2018, 24(10): 1351-1362. DOI:10.1261/rna.064865.117 |
[11] |
Jones PA. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond[J]. Nat Rev Genet, 2012, 13(7): 484-492. DOI:10.1038/nrg3230 |
[12] |
Oh SK, Cho AR, Kwon YJ, et al. Derivation and validation of a new visceral adiposity index for predicting visceral obesity and cardiometabolic risk in a Korean population[J]. PLoS One, 2018, 13(9): e0203787. DOI:10.1371/journal.pone.0203787 |
[13] |
朱玉凤, 张美琳, 李萍, 等. 膳食多不饱和脂肪酸与女性内脏型肥胖的关系[J]. 中国慢性病预防与控制, 2016, 24(3): 192-195. Zhu YF, Zhang ML, Li P, et al. Relationship between dietary polyunsaturated fatty acids intake and female visceral obesity[J]. Chin J Prev Control Chron Dis, 2016, 24(3): 192-195. DOI:10.16386/j.cjpccd.issn.1004-6194.2016.03.008 |
[14] |
高莹, 王碧琦, 高文静, 等. DNA甲基化与肥胖相关性的孟德尔随机化研究[J]. 中华预防医学杂志, 2017, 51(2): 137-142. Gao Y, Wang BQ, Gao WJ, et al. Mendelian randomization analysis of the relationship between obesity and DNA methylation[J]. Chin J Prev Med, 2017, 51(2): 137-142. DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2017.02.008 |
[15] |
Emdin CA, Khera AV, Kathiresan S. Mendelian randomization[J]. JAMA, 2017, 318(19): 1925-1926. DOI:10.1001/jama.2017.17219 |
[16] |
Liu XT, Mao ZX, Li YQ, et al. Cohort profile: the henan rural cohort: a prospective study of chronic non-communicable diseases[J]. Int J Epidemiol, 2019, 48(6): 1756-1756j. DOI:10.1093/ije/dyz039 |
[17] |
杨月欣, 张环美. 《中国居民膳食指南(2016)》简介[J]. 营养学报, 2016, 38(3): 209-217. Yang YX, Zhang HM. Introduction of "The Chinese Dietary Guidelines (2016)"[J]. Acta Nutr Sin, 2016, 38(3): 209-217. DOI:10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2016.03.002 |
[18] |
Craig CL, Marshall AL, Sjöström M, et al. International physical activity questionnaire: 12-country reliability and validity[J]. Med Sci Sports Exerc, 2003, 35(8): 1381-1395. DOI:10.1249/01.MSS.0000078924.61453.FB |
[19] |
Burgess S, Thompson SG. Interpreting findings from Mendelian randomization using the MR-Egger method[J]. Eur J Epidemiol, 2017, 32(5): 377-389. DOI:10.1007/s10654-017-0255-x |
[20] |
Meeks KAC, Henneman P, Venema A, et al. An epigenome-wide association study in whole blood of measures of adiposity among Ghanaians: the RODAM study[J]. Clin Epigenet, 2017, 9: 103. DOI:10.1186/s13148-017-0403-x |
[21] |
van Dijk SJ, Peters TJ, Buckley M, et al. DNA methylation in blood from neonatal screening cards and the association with BMI and insulin sensitivity in early childhood[J]. Int J Obes, 2018, 42(1): 28-35. DOI:10.1038/ijo.2017.228 |
[22] |
Wunderlich CM, Hovelmeyer N, Wunderlich FT. Mechanisms of chronic JAK-STAT3-SOCS3 signaling in obesity[J]. JAKSTAT, 2013, 2(2): e23878. DOI:10.4161/jkst.23878 |
[23] |
Kiu H, Nicholson SE. Biology and significance of the JAK/STAT signalling pathways[J]. Growth Factors, 2012, 30(2): 88-106. DOI:10.3109/08977194.2012.660936 |
[24] |
Waters MJ, Brooks AJ. JAK2 activation by growth hormone and other cytokines[J]. Biochem J, 2015, 466(1): 1-11. DOI:10.1042/BJ20141293 |
[25] |
林丽娟, 魏永越, 张汝阳, 等. 孟德尔随机化方法在观察性研究因果推断中的应用[J]. 中华预防医学杂志, 2019, 53(6): 619-624. Lin LJ, Wei YY, Zhang RY, et al. Application of mendelian randomization methods in causal inference of observational study[J]. Chin J Prev Med, 2019, 53(6): 619-624. DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2019.06.015 |
[26] |
高雪, 杨晓晨, 孟玲先, 等. 睡眠与冠心病的孟德尔随机化因果关联研究[J]. 中华流行病学杂志, 2020, 41(4): 611-614. Gao X, Yang XC, Meng LX, et al. Causal relationship between sleep and coronary artery disease: a Mendelian randomization study[J]. Chin J Epidemiol, 2020, 41(4): 611-614. DOI:10.3760/cma.j.cn112338-20190624-00462 |