2022, Vol. 43
文章信息
- 张楠, 张爽, 王锋, 尹遵栋, 苏秋东, 张国民, 缪宁, 毕胜利, 王富珍, 沈立萍.
- Zhang Nan, Zhang Shuang, Wang Feng, Yin Zundong, Su Qiudong, Zhang Guomin, Miao Ning, Bi Shengli, Wang Fuzhen, Shen Liping
- 我国2015-2017年急性乙型肝炎病例HBV基因型分布特征分析
- Epidemiological distribution of hepatitis B virus genotypes in acute hepatitis B cases in China, 2015-2017
- 中华流行病学杂志, 2022, 43(6): 865-870
- Chinese Journal of Epidemiology, 2022, 43(6): 865-870
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112338-20211230-01041
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文章历史
收稿日期: 2021-12-30
2. 中国疾病预防控制中心免疫规划中心, 北京 100050
2. Department of National Immunization Program, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China
乙型肝炎（乙肝）是全球的重大公共卫生问题，根据WHO数据报告，2015年全球约有2.57亿HBV感染者，每年由于急性肝炎病毒感染及肝炎相关肝硬化和肝癌死亡人数可达到140万，其中约47%是由HBV感染导致[1-2]。我国曾是HBV高流行区，1992年全国乙肝流行病学调查结果显示1~59岁人群HBsAg阳性率高达9.75%，2006年全国1~59岁人群调查结果为7.18%，推测我国乙肝感染者有8 600万，其中慢性乙肝患者2 000万，HBV感染造成严重疾病负担。2014年全国血清流行学调查报告29岁以下人群的HBsAg阳性率下降至2.54%，说明乙肝疫苗免疫取得显著成效[3-4]。根据全国法定传染病报告系统（NNDRS）数据显示，我国急性乙肝的估算发病率为（4.6/10万），并呈逐年下降趋势[5]。根据HBV全基因差异率是否 > 8%，将HBV分为10个基因型（A~J），A型广泛分布于撒哈拉以南非洲、北欧和西非地区；B型和C型在亚洲地区较常见，D型在非洲、欧洲、地中海地区和印度占有优势；E型主要分布于非洲；F型主要分布于南美洲；在法国、德国和美国地区报道有G型的存在；H型在中美洲和南美洲较常见；I型和J型分别在越南和日本有报道[6]。既往报道我国常见基因型为B、C和D型[7-8]，近年来在云南省等地区发现I型[8-9]。乙肝基因型与肝病的严重程度有一定的相关性[10]，基因型与疾病的治疗反应及耐药也密切相关[11]，了解基因型的分布可为疾病治疗提供依据。目前关于我国HBV基因型分布研究人群多为慢性感染者或携带者，缺乏急性乙肝病例基因型的资料和数据，急性乙肝病程与慢性乙肝不同，预后较好，但仍有5%~10%可转变为慢性乙肝[12]，我国每年急性乙肝新发病例数较高，对急性乙肝病例的HBV基因型开展研究有重要意义。为了解我国急性乙肝病例基因型分布情况，本研究收集2015-2017年全国急性乙肝病例样本开展基因分型及全基因序列分析，为我国乙肝防控提供重要依据。
资料与方法1. 资料来源：中国疾病预防控制信息系统2015-2017年共报告疑似急性乙肝病例9 387例，确诊为急性乙肝、信息齐全的病例纳入抽样[13]，采用两阶段随机抽样法抽取620份样本，样本量较少的地区全部纳入研究。见图 1。根据我国行政区划及乙肝的地区分布历史资料[8]，分为7个地区：东北（黑龙江省、吉林省和辽宁省）、华北（河北省、内蒙古自治区、山西省、天津市和北京市）、华东（安徽省、江苏省、山东省、上海市和浙江省）、华中（河南省、湖北省、湖南省和江西省）、华南（广东省、广西壮族自治区、福建省、海南省）、西南（贵州省、四川省、云南省、重庆市和西藏自治区）和西北地区（甘肃省、宁夏回族自治区、青海省、陕西省和新疆维吾尔自治区）。北京市和西藏自治区的基础资料不完整未纳入本研究。
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| 图 1 急性乙型肝炎病例HBV基因型分布研究抽样流程图 |
2. 提取病毒DNA：取血清样本200 μl，采用病毒DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德国QIAGEN公司生产）按照说明书提取DNA，并在-80 ℃保存备用，避免反复冻存。
3. 基因扩增与检测：采用巢式PCR法对全基因组进行扩增，将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，阳性PCR产物送上海生工生物公司进行双向序列测定。获得的原始序列数据使用Sequencher 5.4.6软件进行序列整理与拼接。所用程序及引物参照既往研究[8, 14]。
4. 生物信息学分析：根据文献[15]从GenBank下载HBV各基因型参考株全基因序列158条，序列比对软件选用MEGA 7.0，比对算法采用Clustal W。系统发育树构建软件选用IQTREE，方法用最大似然法（ML），模型采用GTR+I+G，Bootstrap值设置为1 000次。重组分析选用JpHMM在线重组分析工具。根据HBV的S基因片段表面抗原氨基酸第122位（Lys/Arg，d/y）和第160位（Lys/Arg，r/w）确定血清型，并根据127位（Pro-Thr-Leu/Ile，w2-w3-w4）、159位（Ala和非Ala，w1-w2/w4）和140位（非Ser和Ser，w2-w4）进一步确定其亚型。
5. 统计学分析：采用SPSS 22.0软件，率的比较采用χ2检验，双侧检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。运用GraphPad Prism 8.0软件制作相关图形。
结果1. 基本情况：纳入620例样本，成功分型519例（83.71%，519/620），其中以全基因序列分型328例（63.20%，328/519），以约2.5 kb长度分型191例（36.80%，191/519）。成功分型样本与抽样样本性别、年龄和地区分布的差异无统计学意义。见表 1。
2. 基因分型：将519例序列构建系统发育树，并进行基因分型（图 2），获得A、B、C、D、I型及CD重组型，并细分为14个亚型；其中A型仅1例为A2亚型（0.19%，1/519）；B型占27.17%（141/519），主要B2亚型占95.03%（134/141），B3和B4亚型分别占3.55%（5/141）和1.42%（2/141）；C型占62.04%（322/519），其中C1~C6亚型分别占14.60%（47/322）、72.67%（234/322）、0.62%（2/322）、4.35%（14/322）、5.59%（18/322）和2.17%（7/322）；D型占9.06%（47/519），D1亚型95.74%（45/47）和D3亚型4.26%（2/47）；I型4例，占0.77%（4/519），均为I1型；CD重组型4例，占0.77%（4/519），均为CD1型。
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| 注：后验概率标注在进化节点处，蓝色字体的名称代表参考株，黑色字体的名称代表本次毒株 图 2 急性乙型肝炎病例HBV全基因组序列系统进化树 |
根据S区氨基酸进行血清型分型，成功分型515例，其中adr占57.48%（296/515）、adw占30.87%（159/515）、ayr占0.19%（1/515）、ayw占11.46%（59/515），adr和adw为主要的血清型。进一步区分血清亚型，可将adw分为adw2亚型96.85%（154/159）和adw3亚型2.52%（4/159），1例adw未能区分亚型；ayw可分为ayw1亚型11.86%（7/59）和ayw2亚型84.75%（50/59），有2例ayw不能区分亚型。
3. 基因型的地区分布：将我国分为东北、华北、华中、华东、华南、西北、西南7个地区，东北和华北地区C型占绝大多数，分别为94.55%（52/55）和93.85%（61/65），仅有少量B型；华东地区C型比例为78.87%（56/71），B和D型比例分别为19.72%（14/71）和1.41%（1/71）；华南地区包括B、C、I型，C型比例最高，为58.14%（50/86），B型和I型分别为39.53%（34/86）和2.33%（2/86）；华中地区包括A、B、C、I 4种基因型，B型为主58.07%（36/62），A、C、I型的比例分别为1.61%（1/62）、38.71%（24/62）和1.61%（1/62）；西南地区B型比例最高，为52.94%（45/85），C、I和CD重组型占比分别为44.70%（38/85）、1.18%（1/85）、1.18%（1/85）；西北地区D型比例最高，为48.42%（46/95），B、C和CD重组型比例分别为5.26%（5/95）、43.16%（41/95）、3.16%（3/95）（表 2）。
本研究发现的1例A型分布于河南省焦作市；4例I型分别分布于福建省南安市、湖南省怀化市、广西壮族自治区百色市和云南省昭通市；CD重组型共发现4例，四川省遂宁市1例、宁夏回族自治区固原市1例、甘肃省白银市和敦煌市各1例。
4. 基因型与血清型的关系：共有4种血清型，A型的血清型均为adw；B型主要为adw血清型92.14%（129/140）；C型主要为adr血清型91.88%（294/320）；D型的血清型均为ayw，CD重组型的血清型均为ayw；4例I型的血清型均为adw；仅有1例样本的血清型为ayr其基因型别为C型（表 3）。
5. 人口学资料与基因型分布的关系：在男、女性中，均分布有B、C、D、I型和CD重组型，C型均占比最大，分别为60.76%（209/344）和64.57%（113/175）。B、D、I型和CD重组型占比依次为27.03%（93/344）vs. 27.43%（48/175）、10.47%（36/344）vs. 6.29%（11/175）、0.87%（3/344）vs. 0.57%（1/175）和0.58%（2/344）vs. 1.14%（2/175）；1例A型为男性。将两组中B、C、D型构成比进行χ2检验（χ2=2.52，P=0.284），两组之间3种基因型分布差异无统计学意义（表 4）。
0~、21~、41~以及 > 60岁4个年龄组C型均占比最大，分别为56.52%（13/23）、60.52%（138/228）、68.23%（131/192）和52.63%（40/76），除C型外，0~20岁组包括B和D型，占比分别为30.44%（7/23）和13.04%（3/23）；21~40岁组包括B、D、I型和CD重组型，占比分别为28.07%（64/228）、9.65%（22/228）、0.88%（2/228）和0.88%（2/228）；41~60岁组包括A、B、D、I型和CD重组型，占比分别为0.52%（1/192）、23.44%（45/192）、6.77%（13/192）、0.52%（1/192）和0.52%（1/192）；在 > 60岁组中，包括B、D、I型和CD重组型，占比分别为32.89%（25/76）、11.84%（9/76）、1.32%（1/76）和1.32%（1/76）。将4组内B、C、D型的构成比进行χ2检验（χ2=6.77，P=0.342），4个年龄组之间3种基因型分布差异无统计学意义（表 4）。
讨论我国HBV感染者数量高达8 000万~9 000万，开展HBV基因型分布研究对于我国乙肝防控具有重要意义。既往研究结果均显示我国HBV基因型的分布主要与地理位置有关，我国主要流行基因型为B、C和D型，C型主要分布于北方地区，B型主要分布于南方地区，D型主要分布于西北地区[7-8, 16]。本研究的急性乙肝患者基因型中，C型（62.04%）占比最大，其次分别是B型（27.17%）和D型（9.06%）。2010年Yin等[7]成功扩增了全国3 013例HBsAg阳性者样本的HBV S区，分析出C型占68.34%、B型占25.46%、D型占1.53%，与本研究发现的全国HBV基因型的总分布基本一致。2020年Su等[8]成功扩增了全国1~29岁HBsAg阳性者样本的全基因序列369例，其中B型占44.98%，C型占36.59%，D型占5.96%，与本次研究结果相比有一定差异，差异可能与研究样本不同有关。2015年Li等[16]通过国际生物信息网站收集1 148条来自中国各地的HBV基因序列，分析结果为C型占64.37%，B型占27.87%，D型占2.26%，结果与本次研究结果基本一致，但CD重组型占3.66%，I型也有20例，这可能与文献的样本选择偏倚有关。
根据我国行政区域划分东北、华北、华中、华东、华南、西北、西南7个地区进行基因型分布的分析。研究发现华北、东北、华东地区的C型约占78%~95%，华中、西南地区B型比例高于C型，西北地区是D型和C型为主，说明我国急性乙肝的基因型分布规律是东北、华北、华东和华南地区C型为主，华中、西南地区B、C均有，B型为主，D型多分布于西北地区。Su等[8]的研究结果地区分布与本次研究基本一致，显示在我国东北、华北和华东地区C型占比多，西北地区D型比例高，华中/西南地区B型占绝大多数；但华南地区与本结果不同，B型占比多（62.20%），本研究C型占比多（58.14%）；差异可能与Su等[8]的样本构成为29岁以下的免疫人群为主有关。在Yin等[7]的研究中，所有地区均是C型占比最多，与本研究差异较大，本研究在东北、华北和华东地区以C型为主，西南地区以B型为主，西北地区以D型为主，由于华中和华南地区与Yin等[7]的分区不同，无法比较，结果不同可能因为Yin等[7]的研究样本为1~59岁HBsAg阳性人群，本研究的样本为全年龄组的急性乙肝监测病例；也可能由分型所选片段不同所导致，Yin等[7]仅用HBV S区片段分型，本研究用全序列或接近全序列进行基因分型。
既往研究报道在我国青藏高原一带HBV的流行株为CD重组型[8, 16-17]，本研究由于基础资料收集不完整等原因，未能将西藏自治区等青藏高原地区急性乙肝病例样本纳入分析，因此CD重组型仅4例（0.77%）较以往研究的比例偏低。4例CD重组型分布于四川省遂宁市（1/4）、宁夏回族自治区固原市（1/4）、甘肃省白银市（1/4）和敦煌市（1/4）。甘肃省和宁夏回族自治区与青海省相邻，四川省与西藏自治区和青海省均相邻，可能由青藏高原地区传播产生。
I基因型首次在越南发现，2010年该型别首次在我国陕西省报道[9]，此后陆续在我国广西壮族自治区、云南和四川等省份发现[8, 16]，本研究发现的4株I基因型分别位于我国福建省、湖南省、云南省和广西壮族自治区，由于我国西南地区与越南等国相邻，I基因型主要分布于我国西南地区以及与西南地区临近的华南和华东地区部分省份。
A型在我国有少量报道，分布于我国的山东省、福建省和云南省，比例低于1%[18-19]。在对228例献血者研究中，发现A型占全部献血者的3.95%，分布于河南省洛阳市、广西壮族自治区柳州市、云南省昆明市、四川省南阳市及新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市[20]。本研究仅发现1例（0.19%）A基因型，分布于河南省焦作市。结合既往研究可知我国A基因型分布较少，且多分布在我国的西部或东部地区，仅本研究和Li等[16]的研究在我国华中地区河南省发现该型别，差异可能因研究样本不同导致，也可能由该型别逐渐向内陆地区传播导致，仍需进一步研究加以佐证。
本研究共发现adr、adw、ayr、ayw 4种血清型中，B型主要血清型别为adw，C型主要血清型为adr，D型血清型均为ayw，这与Su等[8]的研究结果一致，但I型和CD重组型的血清型分布研究结果不同，本研究I型血清型均为adw；在CD重组型的血清型为ayw，Su等[8]研究结果的血清型为ayw、adw和adr，ayw为其优势血清型，与本研究结果略有差异。造成差异的原因可能是碱基发生了突变而引起的血清分型结果不同，可进一步研究探寻原因。
本研究样本覆盖全国29个省份，可较好地代表我国急性乙肝病例分布，但因基础资料不足未纳入北京市和西藏自治区，且所选样本为全国乙肝监测地区上报的急性乙肝病例，与全国随机抽样选择病例相比可能有一定差异，研究范围仍有一定的局限性，可进一步开展深入研究。
利益冲突 所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明 张楠：实验操作、数据整理与分析、文章撰写；张爽、王锋、苏秋东：实验操作、研究指导；尹遵栋：数据采集；张国民、缪宁：数据采集；毕胜利、王富珍、沈立萍：研究设计、论文修改、研究指导、经费支持
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