我国是HBV感染中流行区，疾病负担较为严重^[1-2]。HBV宫内传播是我国HBV感染的重要传播途径^[3-5]，且HBV宫内传播是目前人群中慢性乙肝感染者积累的重要原因之一^[6]，研究HBV宫内传播的发生机制十分必要。HBV具有高度的变异性，根据其基因组间核酸序列差异性可将其分为多个基因型，在我国以C基因型较为多见^[7-8]。HBV C基因型有两个常见的传统CpG岛，即CpG岛Ⅱ、CpG岛Ⅲ。HBV DNA CpG岛分布在HBV基因组的开放阅读框（S基因、C基因、P基因以及X基因）及顺式作用元件（启动子、增强子等）上：CpG岛Ⅱ与增强子I、X基因启动子区（Xp区）以及X基因区部分重叠，CpG岛Ⅲ在P基因区的起始位点附近^[9-10]。这些HBV基因组结构都与HBV在体内的复制密切相关，而HBsAg阳性母亲体内HBV高复制水平又是宫内传播发生的重要危险因素^[11-12]，由此推测CpG岛在HBV基因组结构上的分布可能与HBV宫内传播有关，其可能会通过影响HBV DNA碱基对的排列顺序而影响HBV在宿主体内的复制、转录和表达，从而进一步影响HBV宫内传播。本研究以HBV C基因型的HBsAg阳性母亲作为研究对象，探讨母亲携带的HBV DNA CpG岛分布特点及与HBV宫内传播的关系，从而为HBV宫内传播机制研究提出新视角，为降低HBV宫内传播提供新思路。

对象与方法

1. 研究对象：连续收集2011年6月至2013年7月山西省太原市第三人民医院妇产科的HBsAg阳性母亲及其新生儿399对。通过面对面问卷调查及电子病历收集母亲的一般人口学资料、本次妊娠情况和新生儿的分娩、出生情况等资料；采集母亲分娩前24 h内肘静脉血及新生儿出生后24 h内乙肝疫苗/乙肝免疫球蛋白注射前股静脉血各3 ml，分装血清于-80 ℃冰箱保存备检。本研究经山西医科大学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

2. HBV宫内传播判定标准：新生儿出生后24 h内且主/被动免疫前，股静脉血HBsAg和/或HBV DNA阳性者判定为HBV宫内传播^[13-14]。

3. 母亲及新生儿HBV血清学标志物及血清HBV DNA检测：采用电化学发光法（ECLIA，试剂购自德国罗氏诊断有限公司）检测HBV血清学标志物（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc），采用荧光定量PCR（试剂购自中山大学达安基因股份有限公司）检测血清HBV DNA载量。

4. 母亲携带的HBV DNA的提取和扩增：使用德国Qiagen公司生产的QIAamp DNA提取试剂盒，严格按照使用说明书操作提取血清HBV DNA。使用梯度PCR仪（德国EPPENDORF公司）进行DNA扩增，DNA分单、双链进行扩增，扩增HBV单链（1 442 bp）用HBV-DF/DR引物（DF：5'-GTC TGC GGC GTT TTA TC-3'，DR：5'-AAG TTG CAT GGT GCT GGT GA-3'）；扩增HBV双链（2 410 bp）用HBV-SF/SR引物（SF：5'-TCA CCT CTG CCT AAT CAT CTC ATG-3'，SR：5'-GCA AAG CCC AAA AGA CCC ACA AT-3'）。PCR为50 μl反应体系，包括3 μl HBV DNA模板，10 μl 5×TransStart^® FastPfu Buffer，4 μl dNTPs，1 μl TransStart^® FastPfu DNA聚合酶，30 μl超纯水（ddH₂O）及上、下游引物各1 μl[引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成]。PCR扩增条件：94 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃单链80 s/双链110 s，35个循环；68 ℃延伸10 min。

5. 母亲携带的HBV DNA测序及基因型确定：将上述PCR产物经凝胶电泳分离回收，将HBV DNA片段连接到pEASY-Blunt Zero Cloning载体，转入Trans1-T1噬菌体抗性化学感受态细胞（北京TransGen生物技术有限公司）进行培养，培养液送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。所得HBV序列经编辑（DNAStar软件包）、拼接（SeqMan软件）、位置调整（Mega 6.0软件包）后采用邻接（Neighbor-joining）法构建系统进化树（Kimura双参数，1 000次验证）。通过与NCBI下载的标准序列比对进行基因分型，详见课题组前期研究^[13-14]。

6. 母亲携带的HBV DNA CpG岛分布预测：利用“MethPrimer”网站（http://www.urogene.org/methprimer/）对母亲携带的HBV DNA CpG岛的分布进行预测。进入网站后，点击“Go to MethPrimer（plus CpG Island Prediction）”界面，输入已经测序确定的母亲携带的HBV DNA序列，调整CpG岛预测所需参数为默认参数（默认参数：片段长度≥100 bp；GC含量≥50.0%；检测到的CpG岛与预期的CpG岛的比值≥0.6），汇总CpG岛的类型、位置及长度等。

7. 统计学分析：用EpiData 3.1软件建库并进行数据录入，采用SAS 9.4软件进行数据分析。非正态分布的计量资料用M（Q₁，Q₃）进行统计描述，计数资料用例数、构成比（%）进行统计描述；计量/计数资料组间比较用Wilcoxon秩和检验/χ²检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

1. 母亲携带的HBV基因型：共收集399对HBsAg阳性母亲及其新生儿，其中54例新生儿发生HBV宫内传播。发生宫内传播者中，22例母亲外周血HBV DNA载量满足克隆测序要求（HBV DNA≥10⁶ IU/ml）；未发生HBV宫内传播者中，91例母亲外周血HBV DNA载量满足克隆测序要求，以随机种子方法选择22例作为对照。

对44例HBsAg阳性母亲的HBV DNA进行扩增克隆测序，HBV基因型分析结果显示：44例样本中39例（88.64%，39/44）为C基因型（均为C2亚型），余2例为B基因型，3例为B/C基因混合型。选择HBV C基因型的39例HBsAg阳性母亲作为研究对象进一步进行HBV DNA CpG岛分布预测，其中宫内传播组19例，未发生宫内传播的对照组20例。

2. HBV C基因型的HBsAg阳性母亲及新生儿的一般情况：39例HBsAg阳性母亲年龄在20~35岁，均为汉族，分娩孕周为37~41周；新生儿出生体重和身长范围分别为2.5~4.3 kg和45~52 cm。比较HBV宫内传播组与对照组母亲及新生儿的一般人口学特征和母亲携带的HBV复制情况，结果显示母亲的年龄、分娩孕周和血清HBeAg、HBV DNA以及新生儿的性别、出生身长和出生体重在两组间的差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。

3. C基因型HBV DNA CpG岛分布与宫内传播的关系：HBV DNA CpG岛分布预测结果显示，39例C基因型中共检出5个CpG岛，包括传统CpG岛Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及新型CpG岛Ⅳ和Ⅴ，且均含CpG岛Ⅱ和岛Ⅲ。HBV宫内传播组仅含CpG岛Ⅱ和岛Ⅲ；对照组均含CpG岛Ⅱ和岛Ⅲ，且有CpG岛Ⅰ、岛Ⅳ和岛Ⅴ各1例。另外，HBV宫内传播组（1例）和对照组（2例）的岛Ⅱ为“中断CpG岛Ⅱ”（中断CpG岛Ⅱ是指CpG岛Ⅱ被非甲基化区域分为两部分）。HBV宫内传播组的HBV DNA CpG岛有2种类型，而对照组共有5种类型，15.00%（3/20）同时还含有CpG岛Ⅰ、岛Ⅳ或岛Ⅴ。见表 2。

4. C基因型HBV DNA CpG岛Ⅱ、岛Ⅲ与HBV宫内传播的关系：HBV宫内传播组和对照组母亲的HBV DNA均含有CpG岛Ⅱ和岛Ⅲ，进一步研究HBV DNA CpG岛Ⅱ、岛Ⅲ与HBV宫内传播的关系。比较两组母亲携带的HBV DNA CpG岛Ⅱ、岛Ⅲ的长度及其CpG位点（CG位点）个数，结果显示，HBV宫内传播组的CpG岛Ⅱ长度及其CG位点个数大于对照组（P < 0.05）；CpG岛Ⅲ长度小于对照组（P < 0.05），但CpG岛Ⅲ CG位点个数在两组间的差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。将CpG岛长度和CG位点个数以三分位数为界分析其分布差异，结果显示，HBV宫内传播组和对照组CpG岛Ⅱ长度及CG位点个数和岛Ⅲ长度分布明显不同（P < 0.05），在HBV宫内传播组中有11例母亲的HBV DNA CpG岛Ⅱ长度≥518 bp，且CG位点个数≥40个，而18例对照组的CpG岛Ⅱ长度 < 518 bp，且CG位点个数 < 40个；在宫内传播组中有10例母亲（10/19）的HBV DNA CpG岛Ⅲ长度 < 149 bp，明显多于对照组（2/20）。见表 4。

5. HBV DNA Xp区和P基因区（P区）的CpG岛分布与HBV宫内传播的关系：测序及CpG岛预测结果表明，39例母亲的HBV DNA CpG岛Ⅱ位置跨越nt1 111~1 717，与部分Xp区（nt1 170~1 359）重叠，CpG岛Ⅲ位置跨越nt2 260~2 466，与部分P区（nt2 307~3 125，nt1~1 620）重叠。进一步分析HBV Xp区和P区的CpG岛分布与HBV宫内传播的关系，结果显示，HBV宫内传播组HBV Xp区（有较多RNA聚合酶Ⅱ结合位点的区域）CpG岛长度大于对照组（P=0.013）。在HBV宫内传播组的19例母亲中有12例母亲携带的HBV DNA CpG岛Ⅱ完全覆盖了Xp区，远多于对照组（5/20）。见图 1。同时，HBV宫内传播组HBV DNA Xp区CG位点个数高于对照组（P=0.041），提示HBV Xp区的CpG岛Ⅱ与HBV宫内传播有关；而P区CpG岛的长度及其CG位点个数在两组之间接近（P>0.05）。见表 5。

讨论

HBV宫内传播无法完全得到有效控制是人群中HBV感染者积累的重要原因^[6]，了解HBV宫内传播发生的机制对于减轻由HBV引起的相关疾病负担具有重要意义。有研究表明CpG岛的分布与下游基因的表达有关^[15]，而HBV DNA CpG岛在HBV基因组结构上的分布有所不同^[8-9]，可能会通过影响母亲携带的HBV在体内的复制而导致宫内传播的发生，相关研究未见报道。本研究发现，C基因型HBsAg母亲携带的HBV DNA CpG岛的分布与HBV宫内传播发生有关，可能为HBV宫内传播机制研究提供新的思路。

HBV是一种因缺乏聚合酶校正功能而具有高度变异性的病毒，根据基因组序列异质性将其分为不同的基因型^[16]，在我国以C基因型较为多见^[7-8]。本研究同样显示大部分的HBsAg阳性母亲的HBV基因型为C基因型（88.64%，39/44），B基因型及B/C基因混合型（11.36%，5/44）较少。

CpG岛是HBV基因组中富含CG双核苷酸的序列，目前普遍认为HBV DNA中有3个传统类型的CpG岛：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，以及3个新发现的CpG岛：Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。本研究中39例HBV C基因型HBsAg阳性母亲携带的HBV DNA均含有CpG岛Ⅱ和岛Ⅲ，其他岛仅在个别研究对象中出现，这与已有研究结果相似^{[9, 15]}。本研究中HBV宫内传播组的母亲携带的HBV DNA仅含有传统CpG岛Ⅱ和岛Ⅲ，对照组含有传统CpG岛Ⅰ及新的CpG岛Ⅳ及岛Ⅴ。HBV宫内传播组的HBV DNA CpG岛的类型较对照组少，提示发生HBV宫内传播的HBV DNA CpG岛类型的分布可能比较保守。本研究还发现部分岛Ⅱ出现“中断”现象，其发生机制和临床意义目前尚不清楚，Hou等^[15]在岛Ⅱ的“中断”区域，检测到了与HBV基因结构和功能异常有关的突变现象，而本研究中仅发现3例，待扩大样本量继续研究。本研究结果还显示对照组有新型CpG岛Ⅳ和岛Ⅴ，新型岛Ⅳ的位置在岛Ⅰ和岛Ⅱ之间，新型岛Ⅴ位于岛Ⅱ和岛Ⅲ之间，新型CpG岛可能是DNA甲基化的潜在区域^[17-18]，关于新型岛的生物学意义还有待进一步探讨。

本研究中HBV宫内传播组母亲携带的HBV DNA CpG岛Ⅱ长度、CG位点个数和Xp区的CpG岛Ⅱ长度、CG位点个数均明显高于对照组（P < 0.05），提示HBV DNA CpG岛Ⅱ长度和CG位点个数与HBV宫内传播有关。一方面，HBV DNA CpG岛Ⅱ与HBV的部分增强子（Enh I）、Xp区以及部分X基因区重叠。Enh I/X基因启动子能与多种核内转录因子相结合，增强启动子的转录水平从而上调前基因组RNA（pgRNA）的表达，而X基因编码的HBx蛋白具有广泛的转录激活功能。Enh I/X基因启动子及X基因的正确表达均有利于维持HBV在体内的高水平复制^[19-20]。另一方面，有研究表明CpG岛的存在与基因调控区相关^[21]，也有研究显示，CpG岛较长的启动子具有更多的RNA聚合酶Ⅱ结合位点^[22-23]。在HBV DNA中，CpG岛Ⅱ覆盖部分Xp区（nt1 170~1 359），启动子区的CpG岛越长，其RNA聚合酶Ⅱ结合位点越多，由于HBV DNA在复制过程中缺乏病毒聚合酶的校对功能，大量的RNA聚合酶Ⅱ的结合位点能够有效校对HBV聚合酶蛋白，减少在复制的DNA链中出现随机的碱基错误合并，避免HBV基因的结构和功能异常，有助于HBV在体内的复制。在本研究中，HBV宫内传播组母亲的HBV DNA载量也相对较高，而母亲体内高病毒载量又是HBV宫内传播发生重要的危险因素，支持了CpG岛Ⅱ的长度及CG位点个数与HBV宫内传播的关系。

本次研究显示，与CpG岛Ⅱ相反，CpG岛Ⅲ短，发生HBV宫内传播可能性高。HBV DNA CpG岛Ⅲ位于部分P区上，但进一步分析HBV DNA CpG岛Ⅲ长度及CG位点个数在P区的分布，发现在两组之间并无差异，出现这种差异的原因还有待进一步探讨。

本研究存在局限性。由于目前测序技术的高载量要求和测序结果的稳定问题，本研究只选择了HBV DNA高载量的母亲及新生儿作为研究对象，无法评估不同HBV DNA水平下HBV DNA CpG岛分布与HBV宫内传播的相关性，因此研究结论需要增加研究样本量进一步深入阐释。

综上所述，HBsAg阳性母亲C基因型HBV DNA CpG岛分布可能与HBV宫内传播有关，HBV DNA CpG岛类型分布保守、CpG岛Ⅱ长度长和CG位点个数多可能会增加HBV宫内传播的发生风险。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  王婷、王丹丹：实验操作、数据处理、论文撰写；陈文鑫、晋聪、李雁笛、扆琳珠：采集、整理数据；丰淑英、汪波：采集数据、支持性贡献；冯永亮、王素萍：研究指导、论文修改、经费支持