孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD），是一类儿童神经发育障碍性疾病，一般在3岁以内起病，主要临床表现为不同程度的社会和（或）交流障碍、狭隘兴趣及重复刻板行为等^[1]。自1943年首次被报道以来^[2]，其发病率呈现逐年上升趋势。WHO 2012年发布的数据显示ASD的全球患病率约为1%^[3]，美国CDC 2020年最新报道数据显示，美国ASD发病率已经达到1.85%^[4]。我国少有大规模流行病学调查数据，据Wang等^[5]2018年发表的汇总44项研究的Meta分析显示，我国ASD患病率约为0.39%，低于世界平均水平^[5]。然而，ASD严重危害儿童身心健康，是我国0~6岁儿童致残的首要原因^[6]；并且ASD会伴随患儿终生，给家庭和社会带来沉重的精神压力和经济负担。

迄今为止，ASD病因尚不明确。遗传学研究显示染色体变异（如儿童16p11.2缺失和重复^[7]、母亲15q11-q13重复^[8]）以及单基因变异（如儿童SHANK3^[9]、CHD8^[10]等基因上的突变）可能与ASD发病风险相关，但目前鉴定到的遗传因素仅能解释10%~30%的孤独症病因^[11]。随着环境因素的作用在各类疾病中的凸显，人们发现环境因素如孕期宫内感染、孕期并发症、化学物质接触等均与子代ASD的发病风险存在关联^[12-15]。近些年的研究普遍支持ASD是由环境、生物和遗传因素等共同作用引起的这一观点。除常见因素外，辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的广泛应用对子代健康的影响也逐渐进入大众视野，但是ART的应用是否会增加子代ASD风险并无定论。我国台湾出生队列^[16]和美国马萨诸塞州^[17]的研究结果显示ART技术的使用与子代ASD发病风险之间并无统计学关联，而Bay等^[18]的研究结果显示虽然卵泡浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）或传统体外受精（invitro fertilization，IVF）治疗后的子代精神类疾病发生风险并不高于自然妊娠人群，但是经历促排卵/宫腔内人工授精出生的子代其ASD等疾病的发病风险略微升高。另外，美国加利福尼亚州对比ICSI和IVF的研究结果显示^[19]，应用ICSI的子代5年内发生ASD的风险显著高于传统IVF人群。除观察性研究外，Meta分析及系统综述对于ART应用是否增加ASD风险研究结论也存在争议。Liu等^[20]的结果显示无论是否进行亚组分析，ART的使用均与较高的ASD风险相关；Djuwantono等^[21]则报道应用ART不会增加ASD风险，但与IVF相比，ICSI的应用会显著增加ASD的患病风险。

既往关于ASD的病因学研究多采用病例对照或横断面研究设计，病因推断能力有限，而利用前瞻性队列研究可以在先因后果的时间顺序上观察暴露因素的致病作用。近年来，国内外已先后开展多项大型出生队列研究，但是专注于某一类疾病尤其是发病率较低的疾病（如子代ASD）的专病队列却很少，同时在ART人群和自然妊娠人群中建设前瞻性ASD亚队列并平行随访的研究尚未见报道。本研究计划依托中国国家出生队列（China National Birth Cohort，CNBC）同步纳入并平行随访ART家庭和自然妊娠家庭的设计建立ASD亚队列，一方面对ART子代和自然妊娠子代ASD发病率进行比较，并分析不孕不育因素及ART和用药方案等对ASD发病率的影响，另一方面系统探讨与ASD发病风险相关的其他行为及临床因素。

一、研究内容

1. 研究对象：满24月龄的南京医科大学附属南京妇产医院（后称南京医院）和附属苏州医院（后称苏州医院）招募并随访的CNBC队列成员（ART和自然妊娠）活产家庭，并且完成改良版婴幼儿孤独症筛查量表（Modified Checklist for Autism in Toddlers，M-CHAT）^[22]。本项目通过江苏省南京市南京医科大学伦理委员会审批，研究对象均已签署知情同意书。

根据既往文献报道，ART与自然妊娠人群中ASD发病风险比RR值约为1.5^[23]，自然妊娠人群发病率假定为2%（各个研究报道的自闭症发病率存在差异，国内报道发病率为0.70%~2.62%不等^[24-25]），α=0.05，β=0.20，经PASS 15.0软件计算后本队列需纳入8 080人（ART和自然妊娠每组4 040人）以保证较高的统计检验把握度。

此外，M-CHAT作为ASD筛查应用最广泛的工具之一，其灵敏度和特异度分别为98%和99%^[26-27]。M-CHAT阳性即可认定为ASD可疑，因而M-CHAT筛查阳性也是我们此次研究的重要结局之一。按照文献报道数据，ART和自然妊娠人群24个月M-CHAT阳性率OR值约为2.0^[28]，本研究现阶段中M-CHAT阳性率约为1.5%，α=0.05，β=0.20，当队列纳入3 226人（ART和自然妊娠每组1 613人）时，可在分析ART是否增加M-CHAT筛查阳性风险的研究中保证较高的统计检验把握度。

2. 流行病学调查：如图 1A所示，随访时间点主要包括：孕前期（仅针对ART人群，药物促排卵前）、孕早期（孕8~14周）、孕中期（孕22~26周）、孕晚期（孕30~34周）、分娩期、子代42 d、子代6月龄、子代12月龄、子代24月龄以及子代36月龄。各随访时间点收集的内容主要包括问卷信息、临床检验检查信息和生物样本。整个随访过程按照实施方案和侧重点不同可分为两部分，第一部分为CNBC随访，主要侧重孕期及生命早期暴露因素收集，涵盖时间点至子代36月龄，此阶段由队列工作人员通过面访或电话随访完成；第二部分为ASD筛查及确诊，主要时间节点为子代24~36月龄。

根据CNBC主队列以及亚队列的随访安排，对队列成员收集如下信息：基线人口学信息；疾病史及家族史；生活方式（吸烟、饮酒等）、心理状态评估（焦虑、压力、抑郁及睡眠状况）；孕期饮食及膳食补充剂、孕期并发症、产检信息；子代生长发育及饮食情况，疾病及睡眠情况，12月龄/36月龄神经行为发育评测（Gesell量表和Bayley量表）等。ART人群还将收集其辅助生殖治疗相关信息。

3. ASD初筛及确诊：

（1）ASD初筛：亚队列纳入的家庭，在子代24月龄时由队列专职人员对其家长通过电话随访的方式进行ASD初筛。ASD初筛采用M-CHAT量表，该量表由于较好的灵敏度和特异度而被广泛应用^[26-27]。

（2）ASD确诊：对于M-CHAT筛查阳性（筛查阳性标准为23项中≥ 3项阳性或6项核心项目中≥ 2项阳性）的儿童，邀约至南京医科大学附属南京脑科医院儿童心理卫生研究中心（后称脑科医院）就诊（图 1B）。脑科医院采用标准流程对儿童进行检查和评估，根据孤独症诊断访谈修订版（Autism Diagnostic Interview-Revised，ADI-R）^[29]、孤独症诊断观察量表（Autism Diagnostic Observation Schedule，ADOS）^[30]，以及依据美国精神医学会精神疾病诊断与统计手册（第五版）（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-fifth edition，DSM-5）诊断标准明确诊断。对于M-CHAT阳性但是无法及时前往脑科医院就诊的家庭，在儿童30月龄时通过电话邀约该家庭就诊，并在儿童36月龄到医院进行面访和体格检查时再次安排就诊。

4. 生物样本的采集和存储：主要收集包括外周血、尿液、粪便等生物样本信息（图 1）。①外周血：男方纳入期外周血；女方纳入期、全孕期（孕早、中、晚）外周血及分娩期产前血；子代脐带血及12/36月龄指尖血；②尿液：男女双方纳入期以及女方孕早期、孕中期尿液；③ASD确诊儿童：尿液以及粪便。对于上述收集的生物样本将严格按照标准化操作流程进行处理冻存（图 2）。

二、现阶段进展

ASD亚队列于2019年1月正式在南京医院和苏州医院启动。截至2020年9月底，3 125个家庭子代满24月龄，其中2 242个家庭完成M-CHAT随访，应答率为71.74%，其中ART家庭72.80%（688/945），自然妊娠家庭71.31%（1 554/2 180）。应答（纳入）家庭与未应答（非纳入）家庭在父母双方年龄、BMI以及孕期吸烟/饮酒方面的差异无统计学意义。但纳入家庭中父母双方文化程度较高，多为经产妇，同时分娩孕周也较大。见表 1。

纳入亚队列的家庭中，ART家庭父母双方年龄及母亲BMI显著高于自然妊娠人群，文化程度低于自然妊娠家庭。与自然妊娠孕妇相比，ART孕妇孕期饮酒人数比例较小，多为初产妇，分娩方式以剖宫产为主，且子代出生时孕周较小。见表 2。

完成M-CHAT问卷的2 242个家庭中，单胎家庭2 074个，双胎家庭168个。累计完成M-CHAT问卷2 410份，其中ART家庭完成问卷841份，自然妊娠家庭完成1 569份。根据M-CHAT阳性判断标准（23项中≥ 3项阳性或6项核心项目中≥ 2项阳性，即可判定为ASD可疑儿童），现阶段共筛查发现38例M-CHAT阳性儿童（阳性率1.58%）。现有38例M-CHAT阳性儿童中，其中11名已在医院接受进一步诊断，共有9名（81.81%）被诊断为ASD，另2名M-CHAT筛查阳性者排除ASD诊断。对于未能及时到医院进一步诊断的儿童，本队列将在其3岁时再次邀约到队列研究中心进行面访及进一步临床检查和诊断。鉴于目前开展亚队列时间较短，完成问卷的家庭数目和M-CHAT阳性儿童数目均较少，尚不足以比较ART和自然妊娠家庭子代M-CHAT阳性率的差异。

三、亚队列可行性分析及展望

本亚队列的建设依托CNBC为主体，在主队列的2家研究中心——南京医院和苏州医院开展。除主队列常规随访外，增加儿童24月龄孤独症问卷筛查，完成筛查的儿童纳入本亚队列研究并进行随访。CNBC主队列经过多年建设和运行，已形成了严谨的随访流程及质控方案，且队列成员依从性较高，孕期及产后各次随访均保持高应答率，为本亚队列研究的可行性提供了保障。亚队列目前的纳入和建设情况显示，辅助生殖和自然妊娠出生的儿童M-CHAT完成率均超过70%。根据主队列进程及亚队列纳入速度估算，1~2年内可达到M-CHAT研究所需样本量，4~5年内达到ASD研究所需样本量。

本研究预期目标主要可分为以下几部分：

1. 同期招募并随访ART与自然妊娠家庭及其子代，早期筛查并诊断ASD患儿，获取中国人群中ART子代和自然妊娠子代ASD发病率，评价两者是否存在系统性差异；

2. 分析不孕不育因素及辅助生殖技术和用药方案等对ASD发病率的影响；系统探讨与ASD发病风险相关的生殖及临床因素；

3. 收集孕期及子代暴露等因素并采集各类生物样本（血液、尿液等），开展ASD多组学研究，揭示潜在病因机制；

4. 开展多学科交流合作，为基础医学、临床医学等领域的研究提供人群队列支持。

四、研究优势与潜在不足

本研究主要优势在于基于ART和自然妊娠家庭同期招募并平行随访的前瞻性出生队列研究，既可以比较ART和自然妊娠子代ASD发病率，评价ART对子代神经行为发育的影响；也可以系统探讨孕期以及生命早期各种暴露对ASD发病的影响。同时，从医院电子病历中获得的各种临床检查、检测及诊断治疗信息，以及多时点收集的各类生物学标本（血液、尿液等），可以支撑下一步ASD病因学研究，为ASD发病机制的探索奠定基础。

本研究主要局限性在于有部分M-CHAT筛查阳性的儿童不能及时在专科医院进行就诊。这可能主要是部分儿童在发病早期症状不易被察觉，并且部分家长对邀约进行ASD诊断存在排斥和抵触心理。为应对此类情况，我们除在24月龄进行常规筛查确诊之外，还开辟了诸如30月龄电话邀约就诊、36月龄面访时邀约就诊、邀请脑科医院医生在南京和苏州医院设点对队列儿童进行诊断等多种筛查确诊途径，以提高M-CHAT阳性儿童就诊率和诊断率。除此之外，ASD实际发病率较低且诊断程序较为复杂，利用队列研究较难在短时间内获得可观的病例样本量，这也在一定程度上限制了研究进展；但是队列研究由于其前瞻性的设计，可以评估纳入人群ASD的发病率，同时可以较好地控制各类混杂因素，并在因果时序上研究ASD的发病危险因素，更好地进行病因学探索。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突