布鲁氏菌病（布病）是世界上流行最广泛的人兽共患病之一，但却因为其不典型的临床症状成为了最容易被忽视的7种疾病之一^[1-2]。目前已经有12种布鲁氏菌被报道，其中引起人类感染的最常见的布鲁氏菌包括羊种、牛种和猪种，其中羊种布鲁氏菌毒力最强^[2]。据报道，叙利亚为发病率最高的国家，其次为蒙古国、伊拉克等^[2]。在2005-2016年的布病病原检测数据显示，羊种布鲁氏菌占到74%，为我国的优势菌种^[3]。在一些皮毛加工厂（剥牛皮、羊皮）、肉类加工厂、屠宰厂等布鲁氏菌可以经过受损的皮肤和黏膜进入人体引发感染；食用未经高温彻底消毒的肉制品和奶制品后，布鲁氏菌可以经过消化道进入人体而引发疾病^{[1-2, 4]}。目前全世界170多个国家和地区存在布病的流行，虽然每年新报告人间患者约为50万例，但实际的发病率却比报道的高15~25倍，每年造成的经济损失高达30亿美元^[5]。我国是畜牧业大国，主要分布在内蒙古自治区、西藏自治区、青海省等北方地区，多以牛羊为主。随着畜牧业的迅速发展，我国牲畜饲养量逐渐增加，畜牧产品的流通速度加快，使布病扩散速度增快，流行范围也不断扩大，成为我国重要的公共卫生问题之一。近年来，布病的诊断已成为热点领域。尤其在低收入国家，寻找一种既快速又准确的诊断方法，这不仅是临床上正确诊断的前提，也是控制布病流行的有力证据^[6]。本文对中国、美国和WHO布病诊断标准进行比较。对我国目前布病的主要检测方法及现阶段分子生物学检测进展进行阐述，并对各种诊断方法的特点进行比较。

一、中国、美国和WHO布病患者定义与分类的比较

WHO、美国CDC和中国CDC分别制定的布病诊断标准，从患者定义、分组、诊断方法试管凝集试验（SAT）的最低抗体滴度等方面存在差异。关于SAT最低抗体滴度方面，中国将抗体滴度定为1:100，WHO和美国CDC将抗体滴度定为1:160^[6]。根据WHO的标准又结合我国的实际情况，在实验室初筛中加入了胶体金免疫层析试验（GICA）、ELISA以及布鲁氏菌培养物涂片革兰染色，在实验室确诊中加入了补体结合试验^[7]。美国CDC诊断标准中包含了PCR方法，但WHO并未将其纳入诊断标准中。PCR方法对于实验人员、场所要求和价格方面均高于其他检测方法，这也是我国和其他发展中国家目前未将其纳入诊断标准的原因之一。本文希望通过WHO、美国CDC和中国CDC的布病患者定义与分类的比较（表 1）和多种检测方法特点的对比（表 2），发现国内外布病诊断标准中的差异，为新修订的诊断标准提供补充依据。

二、布病检测方法的应用

布鲁氏菌的分离培养一直是布病实验室诊断感染的金标准，但是由于实验时间长，生物安全风险高，不适合普遍使用。目前我国使用最广泛的血清学检测方法为虎红平板凝集试验（RBT）和SAT。随着对布病诊断技术研究的深入，许多改良的传统检测方法和新方法不断出现。例如微量凝集试验（MAT）就是在试管凝集试验的基础上改进的一种抗体检测方法，它具有微量、简便且同时可以检测多个样品的能力，可以满足在布病流行地区进行筛查的目的^[17]。还有免疫捕获凝集技术（Brucellacapt）、荧光偏振试验（FPA）、间接酶联免疫吸附试验（iELISA）等新技术逐渐被开发利用。这些试验不仅时间短、操作简便，准确率也比传统试验好。最常用的分子生物学方法为PCR和环介导等温扩增试验（LAMP）等。其中PCR在诊断布病和布鲁氏菌鉴定方面有较大的优势。LAMP是近几年新兴的一个试验方法，具有快速、灵敏的特点，对实验器材、场所、人员要求均不高，是近几年研究的热点。

1.布病各检测方法特点的比较：免疫学检测方法虽然是我国的常用方法，但如果抗体未产生或者其滴度没有达到诊断标准，例如当布病患者从急性期转为慢性期或反复发作期，体内的布鲁氏菌会从吞噬细胞中慢慢转入靶器官中，血清中的布鲁氏菌减少，如果此时只用血清学检测可能会导致漏诊。若错过了最佳的确诊与治疗时机，疾病就会转为慢性期，最后导致迁延不愈^{[16, 18]}。这也是许多临床症状疑似但血清学检测阴性的原因之一。所以对于临床症状疑似血清学检测却是阴性的患者应与细菌学检测联用以减少漏诊^[18]。RBT一开始是用于动物布病筛查，后因其高度的灵敏性被用于人类布病的初筛中。但它的特异度较低，因此出现阳性的患者要再次经过SAT检测才可以被确诊，所以在检测过程中RBT一般会与SAT联用。WHO发行的布病诊断标准中，如果要确诊经RBT、SAT检测的布病患者，还应采用灵敏度和特异度更高的ELISA和Coomb’s检测阳性方可确诊。虽然SAT是我国实验室使用最广泛的试验，也是用于布病确诊的试验，但因其操作复杂，血清用量大，在现场检测中会受到限制。朱明东等^[19]应用了GICA、斑点金免疫渗滤法和SAT 3种方法，对不同布病流行地区的人群的阳性率进行了比较，结果发现3种检测方法差异无统计学意义而在不同流行地区GICA检测结果阳性率差异有统计学意义，且GICA与SAT对于重疫区和非疫区人群的阳性符合率与阴性符合率均在94%以上。基于GICA相对于SAT检测方法简便、血清用量少、灵敏度、特异度高等特点，在布病流行地区有极高的应用前景。

2.布病分子生物学检测的进展：布病诊断的金标准是从患者血液、骨髓或其他体液及排泄物等任意一种材料培养物中分离得到布鲁氏菌，但是这个过程需要在生物安全二级或三级实验室中完成。由于布病血清学检测存在空窗期，存在漏诊现象，所以分子生物学技术的发展正好填补了这个空白。

（1）PCR：陈俊杰等^[20]应用PCR技术对82份试管凝集滴度 < 1:100且布病相应症状未持续一年患者的外周血淋巴细胞中DNA进行检测，结果显示全血淋巴细胞布鲁氏菌核酸检测阳性为50份，血清布鲁氏菌核酸检测阳性为15份。在与血清学检测结果的比较中发现SAT阴性组布鲁氏菌核酸DNA检测率最高为73.1%，这个结果证明全血外周血淋巴细胞核酸布鲁氏菌DNA可以作为血清学检测阴性患者的补充试验。

（2）LAMP：在2000年Notomi等^[21]研发了LAMP，该方法比普通的PCR技术灵敏度和特异度更高，而且操作简便，对于布病临床诊断和布病的病原学诊断具有非常实用的价值。谢文萍等^[22]发现布鲁氏菌LAMP实时浊度法和实时荧光定量法的灵敏度均高于普通PCR，最低检测样品浓度为436 fg/μl，而普通PCR灵敏度的检测最低限为4.36 pg/μg。LAMP实时浊度法和实时荧光法虽然能直接、准确地判断结果，但是需要特定的仪器设备，费用很高。

（3）核酸恒温扩增-免疫层析技术：张慧慧等^[23]对29例就诊患者进行全血与血清核酸提取，将布鲁氏菌核酸样本应用核酸恒温扩增-免疫层析技术进行检测。全血核酸的扩增阳性率为55.2%，血清核酸的扩增率为23.1%，两者差异有统计学意义。在对93例首次就诊的急性早期布病患者核酸恒温检测法与SAT检测法的符合率分析发现两个试验的符合率为63.4%。实验结果表明核酸恒温扩增-免疫层析技术对急性早期的布病患者具有较高的临床应用价值，全血的核酸扩增率远高于血清的核酸扩增率。此技术不需要变性过程只需要恒温扩增后经过15 min便可肉眼观察检测结果，简便快捷且特异度高，是一类适用于基层诊断的实验。

（4）microRNA（miRNA）的应用：miRNA是一类约为22个核苷酸大小的非编码单链RNA，它因为在肿瘤中的重要作用被人们所熟知。miRNA表达的改变与很多疾病相关，参与病原体感染中宿主的固有免疫和获得性免疫应答过程^[24]。在郑源强等^[24]对布病患者与健康志愿者血清中与固有免疫相关的14种miRNA表达情况的研究中发现，与健康志愿者相比布病患者血清中14种miRNA中有13种下调，5种miRNA表达明显降低，分别为miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a、miR-164a。Zhang等^[25]对73例布病患者与65例对照组血清样本中miRNA浓度差异性表达进行研究，结果有3个明显上调，后经qRT-PCR检验布病患者与对照组比较miR-103b上调最明显，且差异有统计学意义，ROC曲线下面积为0.741。虽然现在对于细菌感染后血清中miRNA表达的研究较少，但是在以上研究中可以看出布鲁氏菌感染后血清中miRNA的表达会发生变化，5种明显下调与1种明显上调的miRNA具有潜在的研究价值，在以后的研究中有可能作为布病的辅助诊断标准。

三、总结

我国最新版《布鲁氏菌病诊断》（WS/T 269-2019）与2007版相比删除了实验室初筛中的平板凝集实验和皮肤过敏试验，增加了GICA、ELISA和布鲁氏菌培养物涂片革兰染色这3个试验。并将布鲁氏菌的核酸检测加入了新诊断标准中^{[7, 26]}。MAT试验作为美国CDC布病诊断标准中的实验在中国也有所研究，其具有的微量、简便、同时可以检测多个样品的能力是它独有的优点^[9]。但应该进行多中心大样本的试验评价，使其早日写入诊断标准中。此外，诊断标准中还应增加各期布病患者最佳的诊断方法及其辅助方法，如检测疑似患者时Brucellacapt与iELISA这两种方法联用会减少漏诊率^[10]；急性早期布病患者进行诊断时应使用核酸恒温扩增-免疫层析技术进行辅助诊断；慢性期布病患者应联合应用IgG ELISA和Coomb’s进行诊断^[17]。对布鲁氏菌临床核酸标本的研究，有利于解决布病空窗期问题，减少漏诊；在现场检测和布病流调现场时FPA、LAMP、GICA等试验更适用。miRNA作为一个新兴领域，近几年成为了研究的热点，布鲁氏菌感染人体后血清中miRNA的表达水平可以作为诊断的标志物。许多分子生物学检测灵敏度、特异度很高，但是价格昂贵，今后应多进行改良试验，使价格降低，更适用于基层的布病防控工作，作为布病诊断的补充实验。

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