人间布鲁氏菌病（布病）的危害影响广泛，在170多个国家均有病例报告，每年有超过50万新发病例，是目前最常见的人兽共患病之一，主要传播途径为摄入含有布鲁氏菌的奶类/奶制品，引起结膜/皮肤及呼吸道感染，可引起发热、多汗、乏力、关节肌肉疼痛等^[1-6]。近年来，全国布病疫情持续、快速上升^[7]，布病引起的突发公共卫生事件频发^[8]。本研究利用多位点串联重复序列分析（MLVA-16）方法对人血液中分离的布鲁氏菌进行生物型的分析，为追溯传染源，确定当地布病流行趋势制定相应的防控措施。

1.数据来源：中国疾病预防控制信息系统传染病报告信息管理系统2005-2019年青海省布病网络直报数据。历年人口数据来自青海省统计年鉴。

2.菌株来源：10株布鲁氏菌分离自2005-2019年布病病例血液标本，布鲁氏菌标准参考菌株为羊种（M5）、猪种（S2）和牛种（104M）。

3.病原学鉴定方法：布鲁氏菌的种型鉴定方法根据菌落染色、形态、初代分离培养时二氧化碳（CO₂）的需求、硫化氢（H₂S）量、单相特异性血清A、M凝集试验、染料抑菌性试验、噬菌体的裂解性试验，操作步骤见参考文献[9-10]。

4.菌株DNA制备：细菌DNA的提取，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行（TIANGEN公司）。

5.分子生物学方法：采用BCSP31-PCR和AMOS-PCR方法，引物序列、扩增体系及反应条件见参考文献[11-12]。

6. MLVA-16 PCR方法和统计学分析：16个基因位点，对PCR扩增产物测序，聚类分析采用Bionumerics 7.6软件，以确定菌株MLVA基因型，引物序列及PCR扩增条件见参考文献[13]。采用Excel 2010软件录入数据，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。

1.时间分布：2005-2019年青海省累计报告577例，平均发病率0.07/10万，2005-2010年发病率保持在较低水平0.02/10万~0.05/10万，2011-2019年发病率为0.02/10万~0.27/10万，2019年发病率最高为0.27/10万，不同年份差异有统计学意义。

2.地区分布：577例病例分布在6个自治州（市）的31个县（市、区）中，病例数位居前5位的是门源回族自治县（22.88%，132/577）、天峻县（10.57%，61/577）、西宁市（10.57%，61/577）、河南蒙古族自治县（10.51%，58/577）和海晏县（9.53%，55/577）。

3.人群分布：①年龄、性别分布：年龄范围8~82岁，发病年龄集中在20~49岁。男女性别比为1.8:1（374/203）。②职业分布：以牧民为主（47.83%，276/577），职业类型还包括农民（122例）、兽医（59例）、工人（21例）、医务人员（5例）及其他职业（94例）。

4.菌株种型鉴定：10株布鲁氏菌分离株在普通大气下即可生长，形态及染色特征、培养特性均与布鲁氏菌完全相同；生长时不需要CO₂，不产生H₂S，在硫堇（1:25 000）和复红（1:50 000）环境中均能生长，噬菌体BK₂裂解，Tb不裂解，与血清A、M均凝集，确定为羊种Ⅲ型布鲁氏菌。BCSP31-PCR和AMOS-PCR方法对分离株核酸进行扩增，以羊种（M5）、牛种（104M）、猪种（S2）和大肠埃希菌作为阳性、阴性对照。BCSP31-PCR鉴定，10株分离菌株及阳性对照菌株核酸均扩增出布鲁菌属特异的223 bp的条带，阴性对照无条带出现。AMOS-PCR鉴定，结果显示阳性对照扩增获得了预期片段，阴性对照未见扩增，10株均扩增获得731 bp特异性条带，与羊种布鲁氏菌扩增结果一致，判定为羊种布鲁氏菌。

5. MLVA-16分型：10株布鲁氏菌株包括5种基因型：①2种单基因型分离株（1株分离自青海省大通回族土族自治县，1株分离自安徽省砀山县）；②3种相同基因型分离株（1型基因型有2株分离自青海省达日县和青海省囊谦县，2型基因型有2株分离自青海省门源回族自治县，3型基因型各有2株分离自青海省西宁市湟中区、民和回族土族自治县、门源回族自治县），其差异的串联重复序列位点为Bruce04和Bruce16。见表 1。10株布鲁氏菌株的MLVA-16分型和聚类分析结果显示，同青海省已发表文献的26株羊种Ⅲ型布鲁氏菌的遗传关系较近。见图 1。

表 1 2005-2019年青海省10株布鲁氏菌株采集情况

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图 1 青海省布鲁氏菌分离株多位点串联重复序列聚类分析

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布病在以畜牧业为主的国家和地区较为常见，主要流行在沙特阿拉伯、中东和地中海等国家和地区^[14]。近几年，新疆维吾尔自治区、青海省、内蒙古自治区、西藏自治区的布病发病率呈直线上升趋势^[15]。青海省是布病流行地区，20世纪80年代通过综合防治，疫情下降至“控制区”标准^[16]。本研究发现，2005-2010年青海省布病发病率保持在较低水平0.02/10万~0.05/10万，2011年开始发病率呈上升趋势，2019年发病率最高。10株菌株时间分布为2013年（分离2株）、2018年（分离2株）和2019年（分离6株）。布病病例分布在6个自治州（市）的31个县（市、区），发病呈高度散发状态，并呈现一定地域性，病例数位居前5位的是门源回族自治县、天峻县、西宁市、河南蒙古族自治县和海晏县，年龄范围8~82岁，发病年龄集中在20~49岁青壮年，男女性别比为1.8:1，牧/农民的感染率比其他人群高，与病畜、染菌畜产品接触机会多，有明显的职业特征。人全血中分离的10株菌株中，3株菌株传染源为自繁自育的牛羊，7株菌株为育肥贩卖的羊。近年来的青海省农/牧区和城镇养殖业、育肥产业发展速度较快，加上检疫监管制度不健全，群众缺乏布病防治知识和防护措施，许多未经检疫和患病的牲畜及其制品流通市场，导致了布病的传播。

本研究应用BCSP31-PCR、AMOS-PCR、MLVA-16等3种方法对10株布鲁氏菌分离株的鉴定结果，与传统的生物学鉴定方法相比，操作过程简单、快速，并降低实验室感染风险。姜海等^[17]通过MLVA-16方法结合多重PCR法对24株犬种布鲁氏菌进行遗传关系研究，结果表明该方法可用于布鲁氏菌株的生物型鉴定。10株布鲁氏菌包括5种基因型（2种基因型为单基因型，3种基因型为相同基因型），表明目前青海省流行的布鲁氏菌存在着丰富的基因多态性。聚类分析结果显示，青海省分离的部分菌株间存在共享基因型，部分菌株基因型分型一致，提示近几年门源回族自治县可能存在布病聚集性疫情，这与青海省报告的布病聚集性疫情相一致。MLVA-16方法结合流行病学资料，可用于布病疫情和暴发的预警，查找危险因素，示踪传播途径，进而追溯传染来源。

综上所述，青海省布病疫情呈回升趋势，应加强人群监测和疫情通报，MLVA-16分型呈基因多态性，提示MLVA-16可用于遗传多样性分析和分子流行病学溯源调查，以提高布病监测能力。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突