2020, Vol. 41
文章信息
- 韦超, 杨文慧, 侯雪新, 杨慧盈, 孙丽娜, 周冬生, 李振军.
- Wei Chao, Yang Wenhui, Hou Xuexin, Yang Huiying, Sun Lina, Zhou Dongsheng, Li Zhenjun
- 布鲁氏菌104M液体气溶胶免疫BALB/c小鼠的有效性评价和安全性研究
- Immunization efficacy and safety of Brucella 104M against aerosol challenge in BALB/c mice
- 中华流行病学杂志, 2020, 41(7): 1103-1109
- Chinese Journal of Epidemiology, 2020, 41(7): 1103-1109
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112338-20190911-00665
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文章历史
收稿日期: 2019-09-11
2. 军事医学研究院, 北京 100071;
3. 中国疾病预防控制中心, 北京 102206
2. Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China;
3. Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
布鲁氏菌是一种革兰阴性菌，感染机体能导致人兽共患传染病——布鲁氏菌病（布病）。布病对人畜危害较大，但目前尚缺乏有效治疗措施，疫苗的接种是一种预防控制和减少布病流行最有效的办法[1]。动物疫苗的使用在很大程度上减少了布病的传播，对布病的预防和控制起到重要作用。其中目前WHO和OIE推荐并在很多国家使用动物减毒活疫苗有：羊种Rev.1、牛种S19和RB51，在我国允许使用的有猪种S2、羊种M5、牛种A19[2]，人用减毒活疫苗有19-B和104M，由于19-B明显的副作用，1965年104M的引入取代了19-B[3]。现有使用的减毒活疫苗有致病风险及干扰血清学诊断等副作用，开展克服这些缺点，研发安全有效的新型疫苗是当前研究的热点。通过对现有菌株本身及免疫途径改进是改善免疫效果，减轻副作用的重要方法。
布鲁氏菌104M源于苏联研究者从流产胎牛中分离出来，进行弱化制备的减毒株，曾在我国布病高危人群中使用，该疫苗在实际使用的有关文献发现：104M对人能提供一定的保护力，但有致敏、致病等毒副作用[4]。目前尚没有得到国际认可的人用布鲁氏菌疫苗，对于104M的动物实验研究报道相对较少。本研究基于104M菌株，以BALB/c小鼠为研究对象，展开动物实验研究，初步对布鲁氏菌104M在小鼠体内的安全性及保护力评价，为寻求布鲁氏菌104M疫苗进一步改进措施和对其免疫机制研究奠定基础。
材料与方法1.材料：动物和菌株：6~8周龄18~24 g的BALB/c雌鼠，购自中国北京维通利华实验动物技术有限公司。实验过程中所有小鼠给予充足的水和食物，每天12 h光照。布鲁氏菌104M购自中国兰州生物制品研究所；布鲁氏菌A19购自中国新疆天牧公司。试剂和材料：BBLTM和Brucella Agar培养基、TSA和TSB培养基均购自美国BD公司；Brucella selective supplement购自英国OXOID公司；泊洛沙姆-PlunronicF68购自美国Sigma公司；ELISA试剂盒购自中国深圳达科为生物技术有限公司。
2.方法：
（1）菌液制备和动物接种：取50 μl布鲁氏菌104M甘油菌加入100 ml TSB培养基中，200 r/min 37 ℃振荡培养至对数中期（A600≈1.0），取1 ml菌液加入200 ml培养基中传代扩大培养到对数中期，离心，集菌，用含0.05%（体积百分比）泊洛沙姆的生理盐水洗涤两次，重悬，调整104M菌液2×107菌落形成单位（CFU）/ml免疫接种小鼠。
小鼠随机分6组，每组6只，实验组：液体气溶胶肺递送（M1）、滴鼻（M3）、皮下注射（M5）途径接种1×105 CFU的104M；空白对照组：液体气溶胶肺递送（M2）、滴鼻（M4）、皮下注射（M6）接种等体积含0.05%（体积百分比）泊洛沙姆的生理盐水。M4是滴鼻对照组（滴的是生理盐水）。
（2）症状体征、体重、脾重和脾脏载菌量检测：所有小鼠分别于接种后第4、8、16、24周，称体重，采血，颈椎脱臼处死小鼠，无菌分离脾脏，称重，匀浆，涂布于布氏选择性培养基，37 ℃培养3~4 d，计算脾脏载菌量。
（3）特异性抗体和细胞因子检测：制备血清和肺匀浆上清，分别用试剂盒检测血清抗体IgG、IgM、IgG1、IgG2a和IgA及细胞因子IFN-γ和IL-18，操作方法按照说明书进行。
（4）保护力实验：在小鼠脾脏菌完全清除后，每组小鼠给予5×109 CFU/ml A19液体气溶胶肺递送途径攻毒；在攻毒后2周，收集样品检测，方法同上。以上所有实验操作均在BSL-2实验室完成。
3.统计学分析：定性资料以频数、百分数表示，定量资料体重、脾重、脾脏载菌量及抗体滴度及细胞因子浓度检测，组间分析，经正态性检验，符合正态分布的，采用x±s描述，对不服从正态分布，组间比较采用χ2或Fisher确切概率法检验。采用SAS 9.3软件进行统计学分析，采用Graphpad prism 7.0软件进行多重比较作图。双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1.布鲁氏菌104M免疫后毒力检测：
（1）症状特征和体重变化：每天观察记录小鼠状态，所有小鼠状态均良好，未见耸毛、呼吸困难、精神萎靡、食欲减退、反应迟钝等表现。在检测时间内，与空白对照组（M2、M4、M6）比较，免疫组（M1、M3、M5）均未出现体重显著下降（P＞0.05），M1、M3、M5组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图 1。
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| 图 1 小鼠体重变化 |
（2）脾重变化：空白对照组在攻毒后，小鼠脾重均显著增加；免疫组在攻毒后无显著升高。在第4、8、16周，与空白对照组小鼠脾重0.05~0.10 g比较，免疫组脾脏质量0.10~0.15 g轻度增加（P＞0.05）；在攻毒后2周（免疫24周），M1（0.26±0.16）g＞M2（0.40±0.19）g，M3（0.21±0.11）g＞M4（0.28±0.19）g，M5（0.14±0.02）g＞M6（0.30±0.18）g，（均P＜0.05）。在攻毒前，免疫组组间差异无统计学意义，攻毒后，M1显著高于M3、M5（P＜0.05）。见图 2。
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| 注：a差异有统计学意义（P＜0.05） 图 2 小鼠脾重 |
（3）脾脏载菌量变化：见图 3。攻毒前，免疫组脾脏载菌量在第4周达到高峰[4.6~6.3（log10CFU/g）]，在第20周，免疫组小鼠脾脏菌完全清除；攻毒后第24周，脾脏载菌*M1（4.49±0.13）log10CFU/g＜M2（6.90±0.46）log10CFU/g，*M3（3.59±1.06）log10CFU/g＜M4（7.08±0.14）log10CFU/g，*M5（3.00±2.03）log10CFU/g＜M6（6.81±0.34）log10CFU/g（均P＜0.05）；M1、M3、M5之间比较，P＞0.05，无统计学意义。
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| 注：a组间差异有统计学意义（P＜0.05） 图 3 小鼠脾脏载菌量 |
2.免疫指标评价：
（1）抗体水平检测：见图 4。攻毒前，104M免疫组血清IgG、IgG2a/IgG1、IgA、IgM抗体变化趋势基本一致：第8周达到高峰，之后轻度下降。攻毒后，免疫组和空白对照组抗体水平都显著升高，IgG、IgG2a/IgG1、IgA水平：M1＜M2、M3＜M4、M5＜M6（均P＜0.05）；血清抗体IgM水平：免疫组（M1、M3、M5）均低于相应空白对照组（M2、M4、M6），P＜0.05；M1、M3、M5组间差异无统计学意义，P＞0.05。免疫组血清IgG2a/IgG1＞1。
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| 注：a两组间抗体水平差异有统计学意义（P＜0.05） 图 4 小鼠血清抗体水平 |
（2）细胞因子检测：见图 5，6。血清细胞因子：免疫组均在第4周达到高峰，之后持续下降；攻毒后，IL-18增加显著，而IFN-γ增加不显著。肺匀浆细胞因子：免疫组在第4、8、16周均检测到高浓度IFN-γ和IL-18。空白对照组细胞因子浓度较低，均未检出。免疫组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
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| 图 5 攻毒后小鼠血清、肺匀浆细胞因子IFN-γ、IL-18、IL-1β水平 |
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| 注：a组间差异有统计学意义（P＜0.05） 图 6 免疫后小鼠血清、肺匀浆细胞因子IFN-γ、IL-8水平 |
攻毒后，血清细胞因子：免疫组M1、M3、M5显著低于空白对照组M2、M4、M6（均P＜0.05）。肺匀浆IFN-γ、IL-18、IL-1β浓度：M1＞M2、M3＞M4、M5＞M6（均P＜0.05）差异有统计学意义。免疫组组间差异无统计学意义（P＞0.05）。
讨论本研究基于布鲁氏菌104M，以BALB/c小鼠为研究对象，初步探讨不同的接种途径和剂量的104M对小鼠的安全性及保护力。
本研究通过前期大量试验探索不同免疫剂量，结果发现1010 CFU、107 CFU的104M因剂量过高出现明显的毒副作用，104 CFU剂量过小不能起到有效的保护作用。以105 CFU免疫小鼠，显示出较好的免疫反应及保护力作用，而且未引起小鼠体重显著变化及明显脾肿大，以105 CFU为最佳免疫剂量。
BALB/c小鼠遗传背景清楚，品系稳定，是理想的动物实验模型，也是布鲁氏菌动物实验研究常用的小鼠品系[5]。有研究显示：不同种鼠对布鲁氏菌的反应及敏感性不同[6]。在本研究中，104M在BALB/c小鼠表现出明显免疫反应，但有一定的残余毒力——轻度脾肿大，这与我国曾在人群中使用的反应类似。因此认为，用BALB/c小鼠为动物模型评价104M是合理可行的。
按照1997年WHO确定的评估突变株免疫保护能力的标准，在攻毒后特定的时间内小鼠脾脏或/和肝脏菌数量的减少来衡量[7]。本研究根据前期的研究结果，发现A19作为减毒株，增加接种剂量具有较强的毒性反应，能达到有效的感染，因此本实验选用A19攻毒实验菌株。实验中，我们用A19攻毒后脾脏载菌清除时间作为本研究评价疫苗毒力的标准之一。
毒力是评估疫苗安全性重要方法，国际上通用3种检测布鲁氏菌毒力方法：豚鼠的最小感染量、豚鼠脾脏载菌量及感染后布鲁氏菌在小鼠体内的存活时间[8]。强毒株具有在体内持续感染的特性，弱毒株在与宿主免疫反应对抗中持续繁衍，存在毒力增强的风险。研究显示16M强毒株在小鼠体内清除时间为16周[8]。本研究结果发现105 CFU的104M免疫小鼠后，脾脏载菌清除时间长达20周，说明104M残余毒力明显。
布鲁氏菌减毒活疫苗株比亚单位疫苗、DNA疫苗和基因工程疫苗能提供更好的保护[9-12]。104M是前苏联研究者从流产胎牛分离出来，在实验室弱化减毒而成[13-14]。布鲁氏菌在小鼠脾脏定植数量和时间是评估布鲁氏菌疫苗效力的一种手段。为了检测104M液体气溶胶在小鼠体内免疫有效性，本研究通过用不同免疫途径免疫BALB/c小鼠，待脾脏中的菌完全清除，液体气溶胶肺递送攻毒，测定小鼠脾载菌量、脾重、载菌时间，结果表明104M对BALB/c小鼠有保护力，3种免疫途径无显著差异。但是，气溶胶途径不但克服滴鼻不耐受、剂量不稳定及皮下注射引起局部皮肤溃疡和超敏反应等缺点，而且能在短时间快速免疫大面积人群，对疾病的暴发和流行能起到快速预防和控制作用，具有皮下注射和滴鼻途径无可比拟的优势。
抗布氏菌感染，体液免疫和细胞免疫都发挥重要作用[15]，作为胞内菌，细胞免疫发挥更重要的作用[16]，但是体液免疫也是必不可少[17]。本研究发现104M免疫后小鼠血清出现高水平特异性抗体IgG、IgM、IgG1、IgG2a和IgA，第8周达到高峰，攻毒后再次升高。在小鼠体内，Th1细胞会产生IgG2a型抗体，Th2细胞会产生IgG1型抗体。本检测结果IgG1＜IgG2a，说明Th1免疫作用显著，细胞免疫反应通过细胞因子的参与[18]。Kahl-McDonagh和Ficht[19]通过布鲁氏菌感染敲除IFN-γ基因的小鼠很快死亡，说明IFN-γ对抗布鲁氏菌感染中发挥重要作用。IFN-γ是巨噬细胞释放有助于清除胞内菌的Th1细胞因子[20]。本研究检测肺匀浆细胞因子IFN-γ、IL-18均在攻毒后显著升高，说明攻毒后，诱发局部较强的细胞因子介导的免疫反应；而血清细胞因子显著低于空白对照组，可能是由于免疫组小鼠攻毒后快速激发了细胞免疫反应，攻毒后细胞因子大量消耗，免疫组低于对照组，与攻毒前比较仍显著升高。
本研究首次使用液体气溶胶肺递送装置进行104M液体气溶胶对小鼠的免疫研究，以BALB/c小鼠为实验动物模型，通过3种不同的免疫途径，从免疫和攻毒后体重、脾重、脾载菌量、脾载菌时间等，综合评估104M气溶胶对BALB/c小鼠的最佳免疫剂量、气溶胶免疫途径的安全性和保护力。结果表明104M能激发小鼠免疫反应和保护力，但有一定的残余毒力，缺乏安全性，说明104M作为候选人用疫苗，有待进一步改进。本研究为104M菌株的进一步改进奠定实验基础。目前，对104M的毒力因子和保护机制尚不清楚，有待进一步研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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