中华流行病学杂志  2020, Vol. 41 Issue (4): 571-579   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112338-20190425-00284
中华医学会主办。
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程睿, 南晓伟, 范娜, 付士红, 司晓艳, 张琳, 何英, 雷雯雯, 李樊, 王环宇, 鲁晓晴, 梁国栋.
Cheng Rui, Nan Xiaowei, Fan Na, Fu Shihong, Si Xiaoyan, Zhang Lin, He Ying, Lei Wenwen, Li Fan, Wang Huanyu, Lu Xiaoqing, Liang Guodong
内蒙古自治区采集的蚊虫标本新发现乙脑病毒和盖塔病毒
Emerging of Japanese encephalitis virus and Getah virus from specimen of mosquitoes in Inner Mongolia Autonomous Region
中华流行病学杂志, 2020, 41(4): 571-579
Chinese Journal of Epidemiology, 2020, 41(4): 571-579
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112338-20190425-00284

文章历史

收稿日期: 2019-04-25
内蒙古自治区采集的蚊虫标本新发现乙脑病毒和盖塔病毒
程睿1,2 , 南晓伟3 , 范娜1,2 , 付士红2 , 司晓艳3 , 张琳4 , 何英2 , 雷雯雯2 , 李樊2 , 王环宇2 , 鲁晓晴1 , 梁国栋2     
1. 青岛大学公共卫生学院 266071;
2. 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒性脑炎室 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
3. 内蒙古自治区综合疾病预防控制中心病媒生物防制科, 呼和浩特 010031;
4. 巴彦淖尔市疾病预防控制中心 015000
摘要: 目的 了解内蒙古自治区的吸血昆虫及其携带虫媒病毒的种类及分布, 为虫媒病毒病的预防提供基础数据。方法 在自然界使用灯诱法采集蚊虫标本, 形态学分类后分装编号, 液氮保存。组织培养法进行病毒分离。使用多种生物学信息软件(BioEdit、MEGA等)对病毒核苷酸序列进行分子生物学特征分析。结果 2014、2017-2018年在内蒙古自治区5个县(旗)的采集点共采集到2属3种蚊虫24 240只, 蠓虫17 110只。其中在淡色库蚊标本中检测到乙脑病毒基因阳性, 并且获得4株可以稳定传代的病毒分离物, 经分子生物学鉴定分别为盖塔病毒、浓核病毒。盖塔病毒(NMDK1813-1)E2基因遗传进化分析结果显示, 与甘肃分离株(GS10-2)在同一进化分支, 且有6个共同的氨基酸变异位点。结论 本研究发现的乙脑病毒和盖塔病毒均是在内蒙古蚊虫标本中新近发现的病毒, 这为内蒙古地区的虫媒病毒及其传播疾病的预防及控制提供了基础数据, 对内蒙古的虫媒病毒及其病毒病的预防及控制提出了新的挑战。
关键词: 乙脑病毒    盖塔病毒    虫媒病毒    
Emerging of Japanese encephalitis virus and Getah virus from specimen of mosquitoes in Inner Mongolia Autonomous Region
Cheng Rui1,2 , Nan Xiaowei3 , Fan Na1,2 , Fu Shihong2 , Si Xiaoyan3 , Zhang Lin4 , He Ying2 , Lei Wenwen2 , Li Fan2 , Wang Huanyu2 , Lu Xiaoqing1 , Liang Guodong2     
1. School of Public Health, Qingdao University, Qingdao 266071, China;
2. Department of Viral Encephalitis, State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
3. Department of Vector Biological Prevention and Control, Inner Mongolia Autonomous Region Comprehensive Center for Disease Control and Prevention, Hohhot 010031, China;
4. Bayannaoer Center for Disease Control and Prevention, Bayannaoer 015000, China
Abstract: Objective To investigate the types and distribution of blood-sucking insects and arboviruses in Inner Mongolia autonomous region, and provide basic data for the prevention of arbovirus transmitted disease. Methods Blood-sucking insects were collected by lamp trapping method in nature. Mosquito samples were classified according to morphologic characteristics and then stored at liquid nitrogen. Viruses were isolated in cell culture and characterized, using molecular biological methods. Results A total of 24 240 mosquitoes and 17 110 aphids were collected from 2 sites of 5 counties (Flags) in Inner Mongolia in 2014 and during 2017-2018. Among them, Japanese encephalitis virus gene was detected in Culex pipiens pallens, and 4 virus strains isolates which could be stably passaged. The isolates were identified as Getah virus and densonucleosis virus by molecular biology identification. Phylogenetic analysis on the E2 gene of the Getah virus (NMDK1813-1) showed that it belonged to the same evolutionary branch of the Gansu isolates (GS10-2) and having six common amino acid variation sites. Conclusions The emergence of Japanese encephalitis virus and Getah virus from specimen of mosquitoes in Inner Mongolia indicated the new challenges on the prevention and control of arbovirus and related diseases. The results pf this study provided basic data for the prevention and control stretagies of arbovirus transmitted diseases in Inner Mongolia.
Key words: Japanese encephalitis    Getah virus    Arbovirus    

虫媒病毒是指由吸血的节肢动物所携带,通过叮咬传播给脊椎动物的病毒,病毒可在后者体内扩增。虫媒病毒在吸血昆虫和宿主动物体内的传播和扩增也是虫媒病毒在自然界存在的原因[1-2]。全世界已经发现500余种由吸血昆虫携带和传播的病毒,其传播媒介包括蚊虫、蜱虫和蠓虫等吸血昆虫[3]。虫媒病毒不仅数量多而且分布广,已经发现100余种虫媒病毒可以感染人、畜动物并引发严重疾病[4],如发热、皮疹、关节痛、出血热和脑炎等。全球范围内,蚊虫传播的乙型脑炎(乙脑)病毒每年造成70.9万人伤残寿命年的经济负担,每年有14 300~27 200例幸存的乙脑患者出现长期的神经心理后遗症[5-6]。西尼罗病毒、乙脑病毒、寨卡病毒、盖塔病毒等均由蚊虫传播[7-10]

内蒙古自治区(内蒙古)为传统的牧业区和农业区[11],更适宜蚊虫孳生并带来虫媒病毒传播的问题。为了解内蒙古牧业区和农业区自然界吸血昆虫及其携带的虫媒病毒的差异,本研究开展现场与实验室研究,在采集到的淡色库蚊标本中检测到乙脑病毒和盖塔病毒,这是首次在蒙古高原地区的蚊虫标本中检测到乙脑病毒及盖塔病毒,为后续在动物和人群中开展虫媒病毒感染状况的研究奠定了基础。

对象与方法

1.标本采集:现场为内蒙古土默特右旗明沙淖地区、乌兰察布市四子王旗、包头市土默特右旗和萨拉齐、巴彦淖尔市磴口县和五原县5个县(旗),2014、2017、2018年7-8月在人舍和动物饲养圈等蚊虫环境采集蚊虫和蠓虫标本。使用紫外诱蚊灯(武汉市吉星环保科技有限责任公司)于18:00到次日07:00在采集地点捕蚊。对采集的标本在冰浴条件下进行形态学分类,按照采集环境和种类等信息(蚊虫50~100只1管)编号登记,立即放入液氮中保存并转移至实验室备用。

2.细胞培养:金黄色地鼠肾细胞(BHK-21细胞)、白纹伊蚊卵细胞(C6/36细胞)为本实验室保存。BHK-21细胞培养在90% Eagle’s、7%胎牛血清、1%的青霉素和链霉素(100 U/ml)、1%谷氨酰胺(30 g/L)、1% NaHCO3;C6/36细胞培养在89% RMPI 1640、10%胎牛血清、1%的青霉素和链霉素(100 U/ml)。BHK-21、C6/36细胞分别在37 ℃和28 ℃ 5%CO2培养箱中培养[12]

3.病毒分离:蚊虫50~100只/批,标本使用玻璃研磨器进行研磨。研磨后离心(13 000 r/min,4 ℃,30 min),取研磨上清液100μl分别接种到生长至80%的单层BHK-21和C6/36细胞培养板中(24孔板,Corning incorporated),BHK-21和C6/36细胞分别放入37 ℃,5%CO2和28 ℃培养箱连续培养。每12 h在显微镜下观察细胞病变(CPE),所有标本均盲传3代。细胞出现CPE时收取[12]

4.病毒RNA提取及cDNA制备:按德国Qiagen公司RNA提取试剂盒(Viral RNA mini Kit)说明书进行操作。将提取到的RNA立即放入65 ℃水浴10 min,然后冰浴2 min,取32 μl的RNA放入第一链反应管(Viral RNA mini Kit)中室温静置1 min,加入1 μl的pd(N)6后瞬时离心,37 ℃水浴1 h,使用或放-40 ℃保存[13]

5.引物:鉴定病毒使用的特异性引物来自文献[13-16],结合扩增目的片段长度、引物退火温度等信息,以引物的最适反应条件进行病毒基因的扩增。

6.病毒基因的PCR扩增:PCR反应条件参照引物文献[13-16],取5 μl的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验,将测序结果进行Blast(NCBI)比对,鉴定病毒种类。

7.序列分析:使用Seqman 7.0.5.3软件(DNAStar,Madison,WI)进行核苷酸序列拼接与质量分析;使用BioEdit 7.0软件进行核苷酸多序列比对;使用MEGA6.0软件完成基于Neighbour-joining方法的系统进化分析,Bootstrap值设定为1 000;使用MegAlign 7.1.0软件进行核苷酸和氨基酸序列的同源性分析[13],使用Gene DOC2.6软件进行核苷酸和氨基酸差异分析[16]

结果

1.蚊虫采集情况:共采集到2属3种蚊虫(淡色库蚊、背点伊蚊、刺扰伊蚊)24 240只,蠓虫17 110只。淡色库蚊和背点伊蚊最多,是当地的优势蚊种。见表 1

表 1 内蒙古吸血昆虫采集结果

2.标本基因扩增及病毒分离:对3年采集的标本分223批进行研磨,其中2014年59批,2017年72批,2018年92批。223批蚊虫研磨液分别进行多种属和种特异性引物的病毒基因扩增及细胞感染实验,基因扩增结果显示有5个PCR阳性(包括NMDK1813-1在甲病毒属、盖塔病毒引物PCR获得目的条带;NMDK1811-2、NMDK1815-1、NMDK1825-2在浓核病毒种特异性引物上获得目的条带;标本NMWY1829-1在黄病毒属引物PCR获得目的条带250 bp,经序列比对为乙脑病毒)。接种BHK-21和C6/36细胞,获得4株病毒分离物(NMDK1813-1、NMDK1811-2、NMDK1815-1、NMDK1825-2)。1株病毒在BHK-21细胞表现为细胞圆缩、脱落(图 1A),在C6/36细胞表现为聚团、脱落(图 1B)。3株病毒接种C6/36细胞主要表现为细胞圆缩、脱落(图 1C)。4株分离物均来自2018年采集的蚊虫。所有蠓虫标本和2014、2017年采集的蚊虫标本中未获得病毒分离物。见表 2。对4株病毒分离物也进行了多种属和种特异性引物的病毒基因扩增,结果与蚊虫研磨液的基因扩增结果相对应,序列测序拼接结果显示NMDK1813-1为盖塔病毒;3株病毒株NMDK1811-2、NMDK1815-1、NMDK1825-2为浓核病毒。

注:A1:BHK-21对照细胞;A2:NMDK1813-1病毒分离株接种于BHK-21细胞第3天细胞;B1:C6/36对照细胞;B2:NMDK1813-1病毒分离株接种于C6/36细胞第5天细胞;C1:C6/36对照细胞;C2:NMDK1811-2;C3和C4:NMDK1815-1、NMDK1825-2病毒分离株接种于C6/36细胞第3天细胞 图 1 内蒙古4株病毒阳性分离物在BHK-21和C6/36细胞的细胞病变作用(×200)
表 2 内蒙古自治区蚊虫筛查虫媒病毒阳性结果背景信息

3.病毒分子生物学特征:

(1)乙脑病毒分子生物学分析:虽然未从NMWY1829-1标本获得乙脑病毒分离株,通过乙脑病毒16对引物对蚊虫研磨液标本进行PCR扩增[13],获得部分基因片段,拼接获得乙脑病毒的Capsid、NS4b、NS5基因片段,经序列测定Capsid基因为381nt、127aa;NS4b基因为411nt、137aa;NS5基因为2 235nt、745aa。

将NMWY1829-1与35株不同国家、不同基因型的乙脑病毒构建Capsid、NS5系统进化树。2株进化树皆显示NMWY1829-1为基因Ⅰ型乙脑病毒;Capsid基因的系统进化树显示与2008年中国台湾地区分离株TPC0806C和2012年四川分离株SCYA2012-86亲缘关系较近,NS5基因片段的系统进化分析均显示其与2008年山西分离株SXYC1523亲缘关系较近。见图 23

注:●为内蒙古新分离到的乙脑病毒株;样本编号为采集时间/地点/分离媒介/GenBank号 图 2 乙脑病毒新分离株Caspid基因的系统进化分析
注:●为内蒙古新分离到的乙脑病毒株;样本编号为采集时间/地点/分离媒介/GenBank号 图 3 乙脑病毒新分离株NS5基因的系统进化分析

(2)盖塔病毒分子生物学分析:

① 盖塔病毒E2、编码区全基因区段分子遗传进化分析:盖塔病毒NMDK1813-1 E2基因和编码区全基因核苷酸及编码氨基酸序列分别为1 266nt、422aa;11 166nt、3 720aa。

将NMDK1813-1病毒株与国内外分离到的38株盖塔病毒进行E2蛋白序列的系统进化分析,结果显示2018年内蒙古分离盖塔病毒与2006年以来甘肃从骚扰阿蚊(GS10-2)属于同一进化分支。见图 4

注:●为内蒙古新分离到的盖塔病毒株;样本编号为采集地点/时间/分离媒介/GenBank号 图 4 盖塔病毒新分离株E2基因的系统进化分析

将NMDK1813-1病毒株与国内外分离到的29株盖塔病毒进行编码区蛋白序列的系统进化分析,结果显示病毒株NMDK1813-1与2015年中国河南省从猪体内分离的HNJZ-S2、2012年日本从三带喙库蚊分离的12IH26以及2014-2016年从驴体内分离的14-I-605-C1、15-I-752、16-I-676、16-I-599株亲缘关系较近。见图 5

注:●为内蒙古新分离到的盖塔病毒株;样本编号为采集地点/时间/分离媒介/GenBank号 图 5 盖塔病毒新分离株基因的编码区进化分析

② 盖塔病毒E2基因区段核苷酸及氨基酸序列的同源性比较:盖塔病毒E2基因核苷酸与氨基酸序列同源性分析显示:NMDK1813-1病毒株与马来西亚原始分离株MM2021的核苷酸(氨基酸)序列的同源性94.4%(97.9%);NMDK1813-1病毒株与中国甘肃省分离盖塔病毒GS10-2株的核苷酸(氨基酸)序列同源性最高,为99.1%(100%);与蒙古国分离株(LEIV17741MPR)的核苷酸(氨基酸)序列的同源性为98.6%(99.8%)。

③ 盖塔病毒的E2基因区段氨基酸差异位点分析:本研究分析了1955-2018年世界各地从不同宿主分离的盖塔病毒E2基因氨基酸位点。研究发现,与1955年马来西亚原型病毒株(MM2021)相比,NMDK1813-1存在6个氨基酸差异位点,分别位于E27、E90、E102、E122、E213、E314;其他盖塔病毒分离株与原始株相比,除了均有以上6个共同氨基酸差异位点外,还在E323位点(甘肃分离株GS10-2除外)有共同差异。见表 3

表 3 马来西亚原型病毒株MM2021和其他盖塔病毒毒株间E2基因氨基酸的比较

④ 浓核病毒NS1基因片段的分子遗传进化分析:编号NMDK1811-2、NMDK1815-1、NMDK1825-2检测到浓核病毒NS1基因扩增阳性,经序列测定均为浓核病毒。将NMDK1811-2、NMDK1815-1、NMDK1825-2与17株不同年代、不同分离国家、宿主、基因型[包括浓核病毒属(Densovirus)、短劲浓核病毒属(Brevidensovirus)、环星黑烟浓核病毒属(Pefudensovirus)和重复病毒属(Iteravirus)病毒在内]的病毒NS1核苷酸序列的分子遗传进化分析结果显示,3株病毒株为短浓核病毒属病毒成员。见图 6

注:S:丝氨酸;F:苯丙氨酸;T:苏氨酸;V:缬氨酸;A:丙氨酸;I:异亮氨酸;R:精氨酸;E:谷氨酸;D:天冬氨酸注:●为内蒙古新分离到的浓核病毒株;样本编号为采集地点/时间/分离媒介/GenBank号 图 6 浓核病毒新分离株NS1基因的系统进化分析
讨论

本研究采集到的蚊虫包括库蚊和伊蚊,经鉴定蚊虫以背点伊蚊和淡色库蚊为主,蚊虫采集情况和田兆丰[17]、Cao等[18]的调查结果基本吻合,以往对内蒙古三带喙库蚊的生态习性调查表明[19-20],三带喙库蚊在内蒙古主要分布在呼和浩特市、包头市和巴彦淖尔市磴口县等地,且三带喙库蚊的消长高峰在8月中下旬。本研究未采集到三带喙库蚊,这可能与采集时间有关,采集蚊虫标本的时间多集中在7月下旬和8月上旬,不是三带喙库蚊出现的高峰时期,而且三带喙库蚊一般孳生在稻田、秧田[19],本次调查选址多为农场、牧场,不适宜三带喙库蚊的孳生。

2007 -2008年内蒙古在蚊虫中分离到版纳病毒、浓核病毒以及Tahyna病毒[18]。蒙古国曾在马血清中检测到乙脑抗体阳性[21],2013-2014年在和中国巴彦淖尔毗邻的蒙古国南戈壁省的蜱虫中检测到克里米亚-刚果热病毒(CCHFV)核酸阳性,且ELISA检测到人血清CCHFV抗体阳性[22],在山羊、骆驼等动物体内也都检测到CCHFV抗体阳性[23-24];在采集的蜱虫中分离到蜱传脑炎病毒[25],可见内蒙古及其周边地区的虫媒病毒情况严峻;本研究在内蒙古采集的蚊虫中分离到1株盖塔病毒、3株浓核病毒、并检测到乙脑病毒基因阳性,之前未见内蒙古有分离到盖塔病毒的报道,这30年以来也未见在内蒙古蚊虫标本中检测到乙脑病毒序列的报道。分离到的3株浓核病毒与2008年在内蒙古分离到的浓核病毒同属于短浓核病毒属病毒成员,均是在巴彦淖尔市分离得到[18]

乙脑在我国除新疆维吾尔自治区、西藏自治区、青海省外均有流行[26],但内蒙古自治区此前未在蚊虫中分离检测到乙脑病毒,此次在五原县淡色库蚊标本中获得了2段乙脑病毒基因序列,标本采集地为猪圈,而猪圈和人房毗邻,已有研究显示在人类居所附近有猪圈是导致成年乙脑流行的一个潜在危险因素[26-27]

盖塔病毒属于甲病毒属披膜病毒科的成员[28],于1955年首次在马来西亚捕获的库蚊标本分离到,其原型病毒株为MM2021[29]。目前盖塔病毒已经在澳大利亚、马来西亚、日本、中国、蒙古国和俄罗斯等约10个国家或地区被分离或发现,来源于刺扰伊蚊、三带喙库蚊、马、猪等媒介和宿主[10, 30-32]

盖塔病毒通过蚊虫叮咬而传播,可引起马匹发热,引起猪致死性疾病和生殖障碍[33]等,是重要动物源性病原体。在亚洲如日本、印度曾多次出现盖塔病毒感染引发的马匹疾病流行[34-35]。2017年中国湖南省某养殖场发生盖塔病毒猪感染疫情,百余头猪及幼仔死亡[36],提示我国已经存在盖塔病毒在动物中的流行。NMDK1813-1与甘肃分离株(GS10-2)亲缘关系最近,在E2基因的氨基酸同源性高,差异较小,而且遗传进化分析显示,它与中国河北省、吉林省等北方地区以及蒙古国分离的盖塔病毒不在同一分支,而与2006年我国甘肃省分离的GS10-2在同一分支,提示此次分离到的盖塔病毒株可能由中国甘肃省传来。近些年来内蒙古周边国家(俄罗斯、蒙古国)、中国甘肃、吉林、河北省等均分离到盖塔病毒,内蒙古此前调查中未见分离到盖塔病毒,内蒙古作为我国畜牧业大省,此次分离到盖塔病毒,提示盖塔病毒在我国分布范围进一步扩大,是在北方地区又分离到的一株盖塔病毒,对内蒙古及周边地区的虫媒病毒的防治意义重大。新近研究表明[16],除原始毒株以外的盖塔病毒分离株在E2基因上均存在7个共同的氨基酸突变位点(GS10-2除外),这些变异很可能是盖塔病毒从热带地区逐渐向北传播的分子基础。而本研究分离的盖塔病毒NMDK1813-1与原型病毒株MM2021则在E2基因上仅有6个共同的氨基酸突变位点,这与2006年在甘肃地区分离的病毒(GS10-2)的氨基酸突变位点一致,与其他盖塔病毒株E2基因上共同氨基酸突变位点相比少了E2基因氨基酸第323位,即此位点氨基酸和原始分离株一致。将来,需要更多的病毒基因数据进一步研究盖塔病毒的传播进化和致病性。

综上所述,本研究发现的乙脑病毒和盖塔病毒均是在内蒙古地区蚊虫标本中新近发现的病毒,这为内蒙古的虫媒病毒及其传播疾病的预防及控制提供了基础数据,对内蒙古的虫媒病毒及其病毒病预防及控制提出了新的挑战。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

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