登革热是由黄病毒科黄病毒属登革病毒引起的一种分布广、发病多、危害较大的急性蚊媒传染病^[1-2]。据WHO统计，目前全球已有约128个国家或地区的39亿人口处于登革热风险之中^[3-4]，如今登革热已成为全球性的严重公共卫生问题。在我国，登革热疫情呈明显上升趋势，且以输入性散发病例报告或输入引起的本地传播，主要分布在广东省、云南省等热带、亚热带地区^[5-6]。在河南省禹州市2013年报告了由输入病例引起的登革热本地流行^[7-8]，也说明我国登革热的疫区范围在扩大。河南省作为温带地区首个报道登革热本地流行的地区，具备登革热传播的自然条件和媒介条件，疫情防控形势严峻。为了贯彻“早发现、早评估、早预警、早行动”防控原则，及时发现输入性登革热疫情，2018年河南省加强了登革热的病原学监测研究，为该病的预防控制提供科学的依据。

对象与方法

1.研究对象：利用国家传染病报告信息管理系统，收集2018年河南省疑似登革热病例，包括登革热、登革出血热和登革休克综合征的疑似、临床诊断和实验室诊断病例。

2.病例的相关定义：根据感染地分为输入病例和本地病例。

（1）输入病例：①境外输入病例：发病前14 d内到过登革热流行的国家或地区的病例；②境内输入病例：发病前14 d内离开本县/区（现住址）、到过本县/区外的境内登革热流行地区的病例。

（2）本地病例：发病前14 d内未离开本县/区（现住址）的登革热病例。

（3）确诊病例^[9]：疑似或临床诊断病例中，急性期血清中检测出非结构蛋白1（non-structural protein 1，NS1）抗原或病毒核酸，或分离出登革病毒，或恢复期血清特异性IgG抗体阳转或滴度升高≥4倍。

3.采集标本：登革热病例发生所在地医院和/或CDC，采集病例血清标本3~5 ml，检测登革病毒NS1抗原或IgM/IgG抗体。所在地医院和/或CDC无登革热诊断能力，将病例血清标本送河南省CDC实验室，检测NS1抗原、IgM/IgG抗体并进行核酸检测和基因分型、测序与溯源。

4. NS1抗原与IgM/IgG抗体检测：采用NS1抗原胶体金检测试剂盒（One Step Dengue NS1 RapiDip^TM InstaTestCortez，美国），取血清标本按照试剂盒说明书检测。将血清标本用登革热胶体金免疫层析试剂（澳大利亚Panbio公司）同时检测登革热IgM和IgG抗体。

5.核酸提取与荧光PCR分型检测：取病例血清标本140 μl，用RNA提取试剂盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit，德国Qiagen公司），按说明书进行，最终收集RNA提取液60 μl。以提取的RNA为模板，应用1~4型登革病毒核酸检测试剂盒（中国江苏硕世生物科技有限公司）检测。

6. RT-PCR和序列测定：参考文献[9]，合成可扩增登革病毒核酸引物[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。以上述血清标本中提取的RNA为模板，采用OneStep RT-PCR Kit（德国Qiagen公司），反应条件扩增：50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；循环参数：94 ℃60 s、55 ℃60 s、72 ℃45 s、扩增35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性扩增产物送测序[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

7.同源性分析与系统进化树的构建：利用美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中BLAST模块（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对测序获得的基因序列进行同源性检索与比对，查找相似性最高的基因序列，并结合患者的流行病学史分析可能的来源。搜索并下载登革病毒不同基因亚型代表株序列，利用ClustalX 1.84软件与测序获得的基因序列进行比对，采用MEGA 5.0软件用最大简约法（maximum parsimony methods，MP）构建进化树，分析采用1 000个多序列组（replicates）。

结果

1.基本情况：2018年河南省累计报告登革热病例29例，均为输入性病例，境内输入2例（广州）；境外输入27例，主要来自东南亚地区（25/27，92.6%）和非洲（2/27，7.4%）；东南亚地区中，柬埔寨9例（36.0%）、马尔代夫4例（16.0%）、泰国3例（12.0%）、缅甸2例（8.0%）、印度2例（8.0%）、越南2例（8.0%）、孟加拉国1例（4.0%）、沙特1例（4.0%）、印度尼西亚1例（4.0%）。见表 1。

2.流行病学特征：29例登革热病例中，男性多于女性，男女性别比3.14:1。年龄以＜45岁中青年（72.0%）为主，（37.4±12.5）岁。职业以农民（55.2%，16/29）和商业服务人员（17.20%，5/29）为主。分布于12个地级市（洛阳5例、新乡和驻马店各4例、安阳和周口各3例、许昌和郑州各2例、鹤壁、焦作、开封、三门峡、商丘和信阳各1例），见表 1。时间分布无明显季节性特征，2018年除1、2月外，其他月份均有病例报告。

3.病例的实验室诊断：29例病例中，21例标本由所在地医院和/或CDC检测，8例标本送河南省CDC检测。发病至检测时间间隔3~14 d，中位数6 d。所有报告病例均检测NS1抗原和IgM/IgG抗体，其中NS1抗原和/或IgM、IgG抗体阳性22例。见表 1。

8例登革热报告病例中，有7例为实验室确诊病例，其中6例，经登革病毒1~4型荧光PCR法的基因分型，1型、2型各有3例。见表 2。

4. RT-PCR和序列分析：根据确诊病例的登革热荧光PCR分型结果，选择相应血清型E基因特异性引物扩增，结果仅病例20号的2型登革病毒引物扩增阳性，其余登革病毒扩增为阴性。将病例20号基因阳性扩增产物测序，结果递交NCBI GenBank数据库，命名为Henan201803，获得序列号为MK969680。通过BLAST比对，HN201803与2008年柬埔寨2型登革病毒JF730046一致性最高。

5.系统进化树分析：河南省Henan 201803序列与GenBank中25株2型登革病毒的6个基因型（cosmopolitan、Asian Ⅰ、Asian Ⅱ、American/Asian、American、sylvatic）参考株E基因核苷酸序列构建系统进化树，见图 1。Henan201803属于AsianⅠ基因型，与2008年柬埔寨2型登革病毒JF730046、GU131931进化关系较近。

讨论

WHO登革热预防控制全球策略（2012-2020年）提出呼吁^[10]，登革热是全球性疾病，需要所有相关者的共同参与应对。随着经济贸易全球化的推进和现代交通的日益便捷，全球登革热的发病率急剧上升，每年约有5 000万~2亿登革热感染者，其中有50万重症登革热病例或登革休克患者，每年死亡人数超过2万^[11]。我国是登革热非地方性流行的国家，然而自2012年以来，我国连续4年出现较大规模的本地暴发疫情，特别是2014年广东省疫情达到了我国有史以来最高峰值，报告病例数近4万，近10年来首次出现了登革热死亡病例，防控形势较为严峻^[12-14]。我国先后颁布了“登革热防治技术指南”和“登革热疫情分级防控技术指导方案” ^[15-16]，提出登革热疫情应对应贯彻“早发现、早评估、早预警、早行动”的原则，严防输入传播，预防控制登革热续发病例，避免出现较大暴发或流行，减轻登革热的危害。

我国的登革热疫情以输入病例引发的本地传播为主，本地感染病例集中于云南省、广东省、福建省和浙江省，呈现出高度的时空聚集特征^[17-18]。究其原因，可能与这些地区经济及旅游较为活跃有关，也可能由于这些地区反复发生登革热疫情，当地监测系统敏感性可能较高所致。河南省是曾出现过登革热本地疫情的非地方性流行地区，2013年9月河南省首次暴发登革热本地疫情，73例病例确诊为登革病毒3型感染，分子溯源得出该次疫情分离到的登革病毒株与同年云南省景洪市暴发疫情毒株同源性最高^[7-8]，这也是温带地区登革热引起本地流行的首次报道，提示登革热在我国的地理流行区已经扩大，而河南省已具备本地登革热传播的自然条件和媒介条件，再次发生登革热疫情的风险很大，输入性病例的预防控制是关键。通过2018年对河南省输入性登革热病例的流行病学特征分析，发现河南省输入性登革热病例以境外输入为主，主要是登革热高发的东南亚地区，其次是非洲地区。时空分布分散，无聚集性特征，输入病例较年轻且男性较多，以农民为主，这可能与河南是劳动力输出大省，出国务工人员较多有关。

登革热患者发病前1 d至发病后5 d传染性最强，因此对输入型登革热的预防控制来说，早期诊断和报告对登革热防控具有非常重要的作用^[19-20]。NS1抗原是登革病毒非结构蛋白中唯一的糖蛋白，其大量存在于感染细胞的表面，无论初次或是2次感染登革病毒，人体内均出现NS1抗原的病毒代谢产物，可作为早期诊断的特异性指标，一般在发病后5 d检出率较高^[21]。该方法为血清学检测方法，操作简单，设备要求低，特别适合基层医疗卫生机构作为快速诊断或筛查的方法。2018年河南省登革热的病原学监测由所在地医院和CDC应用NS1进行实验室检测。对比2017年，河南省报告病例仅为8例，6例阳性，均由河南省CDC确诊^[22]，2018年虽然实验室确诊率较低，但由于NS1抗原检测便捷与快速的优势，极大提升了登革热病例的发现能力。2018年河南省登革热病例的分型研究受检测的标本数量限制，可能无法反映出河南省输入性病例的基因型分布特征，仅检测的8例登革热病例中，以1型（3例）和2型（3例）血清型登革热居多。河南省基层实验室具备登革热NS1抗原检测能力，促使登革热实验室诊断病例数目较2017年明显增加，然而也存在登革热病例标本不留存、不送上级CDC复核的问题，还需进一步的完善实验室检测程序和管理规范，加强基因分型和溯源研究。

综上所述，2018年河南省输入性登革热病例较2017年明显上升，但未引起河南省本地流行。登革热尚缺乏有效疫苗和治疗药物，登革热主要采取媒介控制来降低流行和暴发的风险。河南省既往的暴发疫情以输入性病例引发造成本地流行，因此，需加强本地区病例的主动监测，以病例监测为重点，提高诊治水平和实验室检测能力，查明输入性病例的传播来源，从而避免本地病例的发生。

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