肺炎克雷伯菌为革兰阴性杆菌，广泛分布于自然界，亦存在于人体皮肤、呼吸道和肠道等处。肺炎克雷伯菌一般情况下不致病，但当机体免疫力低下或不合理使用抗生素导致菌群失调时可引起肺炎、肝脓肿、菌血症、尿路感染、眼内炎等感染，有时也会引起人的腹泻^[1-3]，是可引起社区获得性感染或医院内感染的潜在病原体。目前关于社区获得性胃肠道感染肺炎克雷伯菌的报道较少。越来越多的医院感染可能会增加社区获得性感染发生的风险，因此，2013－2017年在泰安市开展腹泻门诊病例粪便中肺炎克雷伯菌检出率、耐药特征和分子分型研究，以了解泰安市社区获得性感染肺炎克雷伯菌的存在情况以及其潜在的持续传播的风险。

材料与方法

1.菌株来源：研究现场为泰安市泰山区、岱岳区、新泰市、宁阳县、肥城市及东平县6个县（区、市）的腹泻病症候群监测哨点医院，根据全国监测点抽样框架选取。69株肺炎克雷伯菌株收集自2013－2017年泰安市腹泻病症候群监测哨点医院肠道门诊的腹泻病例的粪便标本，且均为该腹泻粪便标本单一检出致泻病原菌。病例均未服用抗生素类药物，无呕吐，每日排便≥3次，且性状多为水样便；粪便常规检测为白细胞阳性和红细胞阴性。采集的粪便标本于Cary-Blair运送培养基中低温下4 h内送到泰安市CDC进行肠道致病菌的分离鉴定和PFGE分子分型。

2.主要试剂和仪器：Cary-Blair运送培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司，SS琼脂、XLD琼脂、麦康凯琼脂（Mac）及血平板（成品）为北京陆桥技术有限责任公司产品，革兰阴性菌生化鉴定板（美国Beckman Coulter.lnc公司生产），其他培养基均由北京陆桥技术有限责任公司生产。SeaKemGold琼脂糖、10×TBE缓冲液购自美国Bio-Rad公司；SDS、蛋白酶K购自美国Sigma公司；XbaⅠ限制性内切酶购自大连宝生物公司，所有试剂、培养基均在有效期内使用。AS4德灵半自动生化分析仪及生化鉴定板均购自美国德灵公司，Bio-Rad脉冲场凝胶电泳仪、Bio-Rad凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

3.研究方法：依据国家科技重大专项相关子课题的腹泻病症候群监测技术方案进行检测。

（1）菌株的分离培养和鉴定：将粪便标本接种XLD平板、SS平板和麦康凯平板，培养18~24 h，观察菌落形态。对可疑菌落进行涂片、染色镜检，接种三糖铁及MIU培养管进行初步生化反应，并经德灵半自动生化分析仪进行菌种鉴定。

（2）药敏试验：根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的抗生素敏感性试验－微量肉汤稀释法对氨苄西林（AMP）、头孢吡肟（FEP）、头孢曲松（CRO）、头孢西丁（CFX）、阿莫西林-克拉维酸钾（AMC）、亚胺培南（IMP）、阿奇霉素（AMZ）、庆大霉素（GEN）、四环素（TET）、强力霉素（DOX）、氯霉素（CHL）、磺胺异恶唑（SOX）、复方新诺明（SMZ-TMP）、环丙沙星（CIP）、萘啶酸（NAL）共15种常用抗生素进行试验和结果判读，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922（由中国CDC提供）。加样后药敏板经20 h孵育后，肉眼判读的方法对药敏板进行读数，经数据分析得到最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），并根据CLSI的相应标准获得敏感（S）、中度敏感（I）和耐药（R）的结果。

耐药特征：主要分析耐药菌株的耐药率和耐药谱，多重耐药（MDR）指对≥3类抗生素（且每类抗生素≥1种）同时耐药，并且仅指获得性耐药，不包括天然耐药^[4]，分析多重耐药率。

（3）脉冲场凝胶电泳（PFGE）分子分型：按照PulseNet China监测网络中肺炎克雷伯菌的标准分型方法，选用限制性内切酶XbaⅠ对分离菌株的全基因组DNA进行酶切，按照文献中描述的方法进行PFGE操作^[4]。PFGE成像结果导入BioNumberics 7.1软件，经校准后使用非加权配对算数平均法和DICE系数进行聚类分析，构建聚类树，分析菌株间的相似程度。

4.统计学分析：用SPSS 22.0软件进行数据的统计分析处理。通过率（%）和构成比（%）进行统计学描述。率的比较采用χ²检验。双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.菌株来源：2013－2017年泰安市866例腹泻病例的粪便中，共检出肺炎克雷伯菌69株，总检出率为7.97%（69/866）；2013－2017年的检出率分别为5.79%（7/121）、7.65%（14/183）、7.09%（10/141）、14.73%（19/156）及10.44%（19/265），差异无统计学意义（χ²=4.963，P=0.291）。6个县（市、区）肺炎克雷伯菌检出率分别为：泰山区2.86%（11/385）、岱岳区6.29%（9/143）、新泰市18.63%（19/102）、宁阳县12.70%（16/126）、肥城市15.19%（12/79）、东平县6.45%（2/31）。各县（市、区）的检出率差异有统计学意义（χ²=39.627，P=0.000）（表 1）。此外，69株肺炎克雷伯菌分离自69例不同的感染者，其中＜3岁感染者42例，占60.87%（42/69）。

2.耐药性分析：

（1）耐药率：在69株肺炎克雷伯菌中，耐药菌株68株，总耐药率为98.55%（68/69）。其中对AMP耐药率最高，为84.06%（58/69）；其次为SOX，耐药率为72.46%（50/69）；耐药率最低的是IMP，耐药率为2.89%（2/69）（表 2）。

（2）耐药谱：共表现出40种不同的耐药模式，最常见的前5种耐药模式占43.48%（30/69），主要耐药谱为AMP-SOX（n=10）（表 3）；其他各种耐药模式的菌株数均＜2株。其中≥10种抗生素同时耐药的菌株高达8株，占11.59%（8/69）。

（3）多重耐药：考虑到肺炎克雷伯菌对AMP的天然耐药特性，69株菌中23株为多重耐药菌株，多重耐药率高达33.33%（23/69），其中12株对5~8类抗生素同时耐药，占52.17%（12/23）（表 3）。

3. PFGE分子分型：69株肺炎克雷伯菌XbaⅠ酶切后可分为65种不同的型别，相似度为57%~100%，分别命名为X01.SD0001~X01.SD0065（图 1）。各PFGE型别包含菌株数量为1~2株，其中包含2株菌株的型别有4个，分别为X01.SD0022、X01.SD0029、X01.SD0043、X01.SD0057。从整体看，69株菌的核酸序列多态性较多，带型聚集性更分散（图 1）。同一耐药谱可对应不同PFGE型别，如耐SOX-DOX-AMZ-TET的2株菌分别属于X01.SD0006和X01.SD0043两种型别。而同一种PFGE型别中可包含不同的耐药型别，如X01.SD0043型中有耐SOX-AMZ和SOX-AMZ全敏感2种，X01.SD0029和X01.SD0022型中的两株菌分别仅对SOX和CHL的耐药性不同；同一种型别的两个菌株的耐药谱也可完全一致，如X01.SD0057型的两株菌的耐药谱均为AMP-SMZ/TMP-TET（表 4）。同一型别下的两株菌均来自同一年代同一地区；其他菌株的带型与菌株的来源地区和分离年代之间没有一致性关系。在单菌株带型对应的耐药谱中，带型与耐药谱未发现一致性或高相似性。

讨论

作为仅次于大肠埃希菌的第二大条件致病菌，肺炎克雷伯菌存在于人体的上呼吸道和肠道等处。研究表明肺炎克雷伯菌感染可能从肠道定植开始，粪便中的细菌可移位引起其他部位感染^[5]。近年来，由外源性的致病微生物（如志贺菌属、沙门菌属等）引起的腹泻已减少，而内源性的“正常菌群”或是周围环境中毒力较低的细菌、真菌等“非致病菌”，侵袭了抵抗力低下的宿主，如老年人、儿童、重症患者等，导致腹泻或其他感染。粪便中肺炎克雷伯菌的分离和监测具有重要意义。肺炎克雷伯菌可引起社区获得性感染、长期医疗相关的感染及院内感染等，随着抗生素的广泛滥用，并已成为医院内感染的主要致病菌，其检出率为60%~70%^[6]。有研究表明肺炎克雷伯菌是4.8%的社区获得性肺炎的致病菌^[7]。

本研究发现，泰安市哨点医院肠道门诊腹泻病症候群门诊病例粪便中肺炎克雷伯菌检出率为7.97%，进一步表明了肺炎克雷伯菌社区获得性感染的存在^[8]。此检出率和哈尔滨市细菌性腹泻患者粪便标本中该菌的检出率8.09%相近^[9]，但远高于北京地区门诊病例的携带率0.5%^[10]，这可能与地区之间人体肠道菌群构成、卫生条件等差异相关。泰安市肺炎克雷伯菌各年度检出率差异无统计学意义，说明该菌在2013－2017年的检出率变化不大；但各地区检出率有显著差异，可能与各地区的经济水平、生活环境和卫生习惯等有关，其中新泰市检出率明显高于其他县（市、区），表明该地区肺炎克雷伯菌社区获得性感染发生风险较高，应加强监测。此外，≤3岁婴幼儿感染者所占比例较高，这主要与其较低的机体免疫力以及尚未稳定的肠道菌群环境有关，应重点加强婴幼儿肺炎克雷伯菌感染监测，保护易感人群。

肺炎克雷伯菌极易产生耐药性，其高耐药特性被认为是对全球公共卫生的重大威胁^[11]。目前肺炎克雷伯菌引起的食源性疾病事件的报道国内外并不多见，因此对腹泻病例粪便标本中分离的肺炎克雷伯菌株进行耐药性分析的报道更是少见。了解腹泻病例肠道中肺炎克雷伯菌的耐药特性，也将有助于进一步研究肺炎克雷伯菌通过食物链和呼吸链感染获得耐药特性的相关性。从泰安市腹泻病例粪便中分离的肺炎克雷伯菌的耐药率之高、耐药谱之广与有关报道不同^[12]，其中GEN和IMP的耐药率与分离自呼吸道菌株的耐药率不同^[13-14]，这可能与地区差异以及临床上较多地使用多种抗生素有关，同时也表明不同来源的菌株获得耐药机制可能不同。另外碳青霉烯类抗生素具有广泛的抗菌活性，是临床治疗肺炎克雷伯菌感染的有效药物之一。在全部分离株中，2株对IMP耐药，耐药率为2.90%，且分离年份为2016和2017年，说明随着该类药物的广泛使用，腹泻病例肠道中的肺炎克雷伯菌也开始产生碳青霉烯酶，提示需要加强对粪便中肺炎克雷伯菌的耐药监测，同时医疗机构在治疗腹泻病时需要进一步关注菌株的耐药趋势及致病菌株来源，研究合理的用药方案，防止更多肺炎克雷伯菌耐药株的出现。

PFGE技术以重复性好、分辨力强而被称为细菌分子生物学分型的“金标准”^[15]，其结果可用于描述病原菌菌株之间的遗传特性和相关性，追踪监测细菌性传染病的暴发和流行，控制继发性感染等，并为临床诊断和治疗提供分子生物学依据等^[16-17]。本研究显示，泰安地区的肺炎克雷伯菌的PFGE型别呈较独立的多态性分布状态的特点，与李兵兵等^[18]报道的分离自血液、尿液及痰液中的肺炎克雷伯菌的PFGE带型多样性特点相符，未发现有优势带型与聚集现象，提示近几年泰安市内肺炎克雷伯菌引起的腹泻呈现高度散发状态，发生大规模流行的可能性较小。但从聚类分析图上可以看出，在65种带型中有47个遗传相似度高于80%，遗传距离较近，提示变异中存在的相对稳定性。对PFGE带型完全相同的菌株流行病学调查发现：耐药谱、分离年代和地区完全相同的，提示该型别存在散发流行可能。此外结合PFGE带型分析看，耐药谱相近或一致的多重耐药菌株和其他菌株之间的相似性不高，提示多重耐药性垂直传递的可能性不大，可能更多地源于种属间的水平转移和抗生素的高选择压力。研究还发现，PFGE带型与耐药谱间无相关性关系，对于这些肺炎克雷伯菌株关联度、传播模式以及相关疾病传播链的追溯还需要结合其他分子分型技术和流行病学调查资料进行进一步验证和研究。

综上所述，肺炎克雷伯菌存在于泰安市各地区腹泻病症候群门诊病例的粪便中，能够引起社区获得性感染；能够对多种抗生素耐药，耐药谱广，多重耐药率高；PFGE带型呈现多样性，无耐药谱对应性。应高度重视和加强对该来源菌株的监测，防止更多的耐药菌株的产生和传播，保护易感人群。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突