汉坦病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属（hantavirus，HV），是有胞膜、单股、负链、分节段的RNA病毒，其基因结构分为大（L）、中（M）、小（S）3个片段，分别编码病毒的RNA聚合酶、糖蛋白（GP）G1和G2以及核衣壳蛋白（NP）^[1]。HV的宿主动物是啮齿类动物并由啮齿动物传播给人类，人类感染HV主要导致肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）和HV肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS）。HV包括汉滩病毒（hantaan virus，HTNV）、汉城病毒（seoul virus，SEOV）、多布拉法-贝尔格莱德病毒（dobrava-beigrade，DOBV）、普马拉病毒（puumala virus，PUUV）等型别的病毒^[2]，我国以HTNV和SEOV为主要流行株^[3]。

中国是HFRS流行的主要地区，发病率占全世界90%以上^[4]，浙江省是我国HFRS的主要疫区之一^[5]，天台县又是浙江省HFRS的高发区。庞卫龙等^[6]报道天台县自1965年发现首例HFRS以来，疫情开始逐渐上升，20世纪80年代达到高峰，1983年发病822例，发病率为170.4/10万，居浙江省首位^[6]。1984年开展监测并采取针对性防治措施，发病率逐年下降，但仍是全国疫情较重的发病县之一，为HFRS国家监测点。

为了研究天台县HV的基因型别分布及病毒进化变异规律和流行趋势，我们持续对该地区的HV宿主动物进行调查^[7]。本研究在前期的工作基础上利用HTNV和SEOV特异性引物，应用巢式PCR方法对2011-2018年HV抗原阳性的鼠肺标本进行病毒核酸扩增分型和序列测定，将本次测序的天台HV部分M片段序列与HV国内外其他病毒株进行比较分析。

1.研究样本：来自2011-2018年浙江省HFRS国家监测点天台县捕获的野外和居民区鼠形动物中HV抗原阳性的鼠肺标本67份。

2.病毒RNA提取：天台县HV抗原阳性的鼠肺标本经超声粉碎后采用EX2400核酸自动提取仪（上海之江生物科技股份有限公司）进行RNA提取，最后用40 μl的无RNA酶的去离子水溶解，-70 ℃保存备用。

3.巢式PCR分型和测序：使用M-MLV反转录酶和反转录引物（5′-TAGTAGTAGACTCC-3′）合成cDNA；应用M片段的通用外引物（上游引物：5′-AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG-3′、下游引物：5′-GTACAICCTGIRCCIACCCC -3′）；型特异性引物：HTNV上游引物（5′-GAATCGATACT GTGGGCTGCAAGTGC -3′）、下游引物（5′-GGA TTAGAACCCCAGCTCGTCTC -3′）；SEOV上游引物（5′- GTGGACTCTTCTTCTCATTATT-3′）、下游引物（5′-TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG -3′）；PCR扩增的反应条件为95 ℃ 10 min，94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 45 s，扩增30个循环，72 ℃延伸12 min；扩增产物用1%~2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，若条带的分子量与预期片段大小相同（HTNV扩增片段长度为385 bp，SEOV扩增片段长度为418 bp），则表明为特异性扩增产物，确定病毒的型别。天台县鼠肺标本经巢式PCR扩增后的阳性产物委托杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序。

4.分析用毒株：选取DNA序列数据库（GenBank）有代表性的27株HV与天台县2011-2018年31份HV的序列进行比较分析，HTNV 17株和SEOV 10株，包括HTNV国际标准株76-118、SEOV国际标准株80-39、浙江省以往分离株及国内外其他分离株。27株病毒的型别、名称、宿主动物、来源以及序列号等信息，见表 1。参照孙彦峰等^[8]对HV基因分型的研究，本研究的30株天台黑线姬鼠携带的病毒为HTNV的同一亚型；1株天台黑线姬鼠携带的病毒为SEOV，与浙江株Z37、ZT71和ZT10同为一个亚型。

表 1 研究中用于系统发生分析的毒株信息

表选项

5.核苷酸序列分析：2011-2018年天台县31份HV与GenBank中选择的国内外有代表性的27株HV，利用M基因G2区2003~2303 nt的核苷酸序列，应用Mega 5.0和DNA Star 7.1软件包进行系统发生分析，以邻位相连法（NJ）、T92+G模型构建系统进化树^[8]，分析病毒基因的型别和进化变异。

1. PCR检测及分型：采用巢式PCR方法，从天台县67份HV抗原阳性的鼠肺标本提取RNA，利用HTNV和SEOV特异性引物，经巢式PCR扩增，30份标本用HTNV特异性引物扩增出目的条带385 bp（2012年4份：T2012-52、T2012-58、T2012-61、T2012-80；2013年9份：T2013-2、T2013-9、T2013- 10、T2013-15、T2013-16、T2013-35、T2013-36、T2013- 66、T2013-67；2017年5份：T2017-2、T2017-3、T2017-12、T2017-63、T2017-71；2018年12份：T2018-9、T2018-108、T2018-123、T2018-130、T2018- 131、T2018-133、T2018-148、T2018-153、T2018- 164、T2018-167、T2018-180、T2018-187），而用SEOV特异性引物未扩增出基因片段；1份标本用SEOV特异性引物扩增出目的条带418 bp（2016年1份：T2016-31），而用HTNV特异性引物未扩增出基因片段。31份PCR产物阳性标本均来自黑线姬鼠，这表明PCR产物阳性的30只黑线姬鼠携带HTNV，1只黑线姬鼠携带SEOV。HTNV和SEOV PCR产物条带示意图见图 1。

注：M：Mark；1和2：HTNV阳性鼠肺标本HTNV引物；3和4：HTNV阳性鼠肺标本SEOV引物；5：HTNV阳性对照Z10株HTNV引物；6：阴性对照（H2O）HTNV引物；7：SEOV阳性鼠肺标本HTNV引物；8：SEOV阳性鼠肺标本SEOV引物；9：SEOV阳性对照Z37株SEOV引物；10：阴性对照（H2O）SEOV引物 图 1 HV抗原阳性鼠肺标本经型特异性M基因引物巢式PCR扩增分型结果

图选项

2.同源性分析：天台监测点HV M基因G2区2003~2303 nt处300 bp的核苷酸序列经测序，30株HTNV中的T2018-130株与天台县其余29株及HTNV国际标准株76-118和国内外其他株相比较同源性差异均较大，T2018-130株与天台县其余29株同源性为84.8%~87.9%，与HTNV国际标准株76-118同源性为74.2%，与邻县嵊州市Z10株（本实验室HTNV疫苗株）同源性为76.0%，与国内外其他HTNV同源性为76.8%~86.6%；而天台县其余29株HTNV之间同源性为95.3%~100.0%。1株来自天台县黑线姬鼠的SEOV T2016-31株与SEOV国际标准株80-39同源性为93.4%，与同为天台县2003年分离自褐家鼠的SEOV ZT71株和2004年分离自东方田鼠的ZT10株同源性分别为98.7%和99.3%，与浙江省新昌县和温州市分离株同源性为92.0%~99.0%和84.1%~85.4%。

3.病毒基因系统发生树分析：利用M基因G2区2003~2303 nt的核苷酸序列进行系统发生分析，2011-2018年天台县监测点的31株病毒中30株分布在HTNV单元群，从系统发生树上看同为天台县的29株亲缘关系较近，分布较集中，而天台县T2018-130株与其余天台株及国内外其他株相比亲缘关系较远，但还是与天台株同分布在HTNV单元中的一个分支。来自天台县黑线姬鼠的SEOV T2016-31株分布在SEOV发生群，与天台株ZT10、ZT71和温州株Z37（本实验室SEOV疫苗株）构成一进化支，亲缘关系较近。构建的进化树见图 2。

注：-：信息未检索到；NR：序列未注册到GenBank；SNV：辛诺柏病毒；KBRV：哈巴罗夫斯基病毒 图 2 天台县2011-2018年HV与国内外代表性HV部分M片段核苷酸序列（2003~2303 nt）以NJ法构建的系统进化树

图选项

HV引发疾病的类型及其严重程度取决于病毒的型别。因此，对HV的分型以及阐明病毒之间的关系对HV病原学理论研究及其防治具有重要的意义。HV的基因结构分为大（L）、中（M）、小（S）3个片段，3个基因片段的核酸变异以M基因片段的变异最显著，被认为是决定HV毒力和致病性的主要因素^[9]。不同型别HV的M片段核苷酸序列有明显差异，是研究HV基因变异和分型的主要区域^[10]。张永振等^[11]研究发现以NJ法用G2区的2003~2303 nt的核苷酸序列可以代替G1、M或M+S基因片段的全序列构建系统发生树对HV进行分型，而且NJ法可能优于最大简约法。基于病毒基因序列数据分析不但能对病毒进行基因分型，而且也能较好地反映病毒间的系统发生关系。本研究利用巢式PCR分型技术及核苷酸序列测定技术，采用NJ法对2011-2018年天台县HV M基因G2区2003~2303 nt的核苷酸序列构建系统发生树进行病毒基因分型及进化分析。巢式PCR经HTNV和SEOV型特异性引物扩增，67份HV抗原阳性鼠肺标本HTNV 30株、SEOV 1株。HTNV的主要自然宿主为黑线姬鼠，姚苹苹等^[7]对天台县2011-2018年HV宿主动物进行了调查监测，发现当地鼠种78.0%为黑线姬鼠，本研究67份HV抗原阳性鼠肺1份来自褐家鼠，其余66份均来自黑线姬鼠。天台县属以黑线姬鼠为主要传染源、HTNV为主SEOV为辅的HFRS混合型疫区。

30株HTNV中29株病毒核苷酸同源性高达95.3%~100.0%，而T2018-130株与其余29株同源性为84.8%~87.9%，但与HTNV国际标准株76-118和国内外其他株相比较同源性更低，与76-118株为74.2%，与国内外其他HTNV为76.8%~86.6%。从系统发生树看，T2018-130株还是与天台县其余29株病毒分布在HTNV单元群中的同一分支，属同一亚型。

1株SEOV T2016-31来自黑线姬鼠，与SEOV国际标准株80-39同源性为93.4%，与同来源于天台县本实验室2003年分离自褐家鼠的SEOV ZT71株^[12]和2004年分离自东方田鼠的ZT10株^[13]同源性分别为98.7%和99.3%，与20世纪80年代分离自新昌县和温州株的同源性为92.0%~99.0%和84.1%~85.4%。从系统发生树看，本研究T2016-31株与天台县以往分离ZT10、ZT71株分布在同一进化支，同属一个亚型，3株同地区不同宿主来源的SEOV在系统发生树上亲缘关系较近。这个现象再次证明浙江省HV的基因差异和亲缘远近关系主要表现在地区性，而与病毒的宿主关系并不大^[14]。这种地区性现象在浙江省的SEOV尤为明显，徐芳等^[15]曾发现在浙江省建德市存在SEOV发生群中独立分支的特殊亚型病毒Gou3和ZJ5株，这2株病毒系本实验室分别在1981和2001年分离^[16]，时间跨度20年，但基因序列表现出高度的地区同源性^[14]。

多年的HV进化理论认为HV与其原始宿主间存在共进化关系，即一个型别的HV往往只有一种原始宿主动物，即每型病毒具有相对稳定的宿主与啮齿类动物的种类形成对应关系^[17]，一般认为同一个型别的HV在一定区域只有一种宿主动物。浙江省的HTNV和SEOV的宿主动物大部分分别为黑线姬鼠和褐家鼠，但HV在与宿主的共进化过程中，也会出现病毒与宿主动物不一致的现象。2003年本实验室从天台县的褐家鼠中分离到SEOV ZT71株，2004年率先从天台县的东方田鼠中分离到SEOV ZT10株，本研究又从天台县的黑线姬鼠中发现SEOV T2016-31株。天台县的这种原始宿主与其携带病毒不一致的现象称为宿主“溢出”（spillover），国内近年研究也证实了不同型HV基因宿主转换现象：Liu等^[18]研究发现湖北省出现SEOV溢出感染HV的自然宿主黑线姬鼠；范胜涛等^[19]也报道了吉林省的褐家鼠、黑线姬鼠和小家鼠中均检测到SEOV的存在。宿主溢出可能是暂时的，很快在动物体内得以清除，对病毒的进化和维持没有太大的意义；但也可能是永久性的，发生宿主转换并加以进化^[20]。

天台县属浙中丘陵山区，其中山丘占天台县总面积的82.3%、溪流山塘占4.0%，气候温暖湿润，生态环境非常适合啮齿类动物的生存和活动，是浙江省乃至全国重要的HFRS自然疫源地。本实验室研究发现天台县SEOV进化过程中由褐家鼠溢出到东方田鼠和黑线姬鼠，而且这一模式在鼠类中可能不断循环。天台县HV主要以HTNV为主的地区聚集性及SEOV可能不断进化突破了宿主之间的间隔现象，使此地HV防控形势变得更加严峻。因此，有必要持续深入开展HV的宿主动物调查和病毒基因进化变异研究，进一步了解HV进化规律，为寻找HV的进化动力提供资料。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突