文章信息
- 张磊, 王海荣, 邵昱璋, 严敏, 付婷, 胡妮, 高洁.
- Zhang Lei, Wang Hairong, Shao Yuzhang, Yan Min, Fu Ting, Hu Ni, Gao Jie.
- HBsAg阳性产妇孕晚期IFN-γ和IL-12表达对HBV宫内传播的影响
- Effect of IFN-γ and IL-12 expressions on intrauterine transmission in HBsAg-positive parturientsin late pregnancy
- 中华流行病学杂志, 2019, 40(9): 1077-1083
- Chinese Journal of Epidemiology, 2019, 40(9): 1077-1083
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2019.09.011
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文章历史
收稿日期: 2019-02-18
2. 西安交通大学医学院 710061
2. Medical College, Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China
目前,全球约2.57亿HBV携带者[1],其中HBV垂直传播无法完全阻断而成为研究热点,最新研究提出HBV宫内传播(BIT)不仅包括HBV显性感染(DBT),而且还存在HBV隐匿性感染(OBI)现象[2]。HBV感染时,活化Th1型免疫应答中促进IFN-γ、白细胞介素12 (IL-12)的分泌,在病毒清除过程中发挥关键的效应和调节作用[3],因此本研究通过监测HBsAg阳性产妇外周血IFN-γ和IL-12水平,以探讨母体IFN-γ、IL-12水平对HBV宫内传播结局的发生产生影响。
对象与方法1.研究对象:收集2015年1月至2017年5月陕西省西北妇女儿童医院住院产妇282例,其新生儿285例。纳入标准:①HBsAg阳性产妇;②所生新生儿在出生24 h内未接种乙型肝炎(乙肝)疫苗和卡介苗前采集静脉血;③新生儿身体状况符合抽血条件;④知情同意。
2.研究方法:采用病例对照研究方法,比较病例组HBsAg阳性与对照组HBsAg阴性产妇外周血IFN-γ和IL-12水平的差异。HBsAg阳性产妇采取干预措施包括:抗病毒治疗、接种乙肝疫苗和注射免疫球蛋白(HBIG)情况。
(1) 分组:采用两组水平均数比较的样本量估计方法,根据IFN-γ检测预实验数据设定相关参数:病例组(27.63±30.00)pg/ml,对照组(11.11±20.53)pg/ml。等比例分组,采用PASS 16.0软件计算病例组与对照组样本量各为40例。同期随机选择43例正常产妇为对照组,纳入标准:①产妇血清HBsAg及HBV DNA均为阴性;②年龄匹配;③居住地匹配;④新生儿身体状况符合抽血条件。排除标准:①罹患其他感染性疾病;②未签署知情同意书。
(2) 问卷调查:产妇的一般情况、家族史、本次妊娠史以及生产情况和新生儿情况等。
(3) 标本采集:采集临产前HBsAg阳性产妇及其新生儿(出生24 h内)静脉血,并采集43例对照组产妇外周血。均1 500 r/min、6 min分离血清,-20 ℃保存备用。
(4) 血清HBV标志物检测:产妇及新生儿HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc(乙肝五项)均采用ELISA法检测,操作和结果判定按试剂盒说明书(北京万泰生物药业股份有限公司)进行。HBV DNA载量采用PCR-荧光探针法检测,操作和结果判定按照试剂盒说明书(湖南圣湘生物科技有限公司)进行。
(5) 产妇外周血IFN-γ和IL-12检测:采用流式液相芯片法检测,7-PLEX HUMAN CYTOKINE PANEL 96 well plate Assay (SPR1036)试剂盒(美国MILLIPLEX公司)。各种检测均严格按照试剂盒说明书进行操作和判读结果,采用流式检测仪Luminex®200TM(美国伯乐公司)检测。
(6) 新生儿HBV感染结果判定:① BIT:DBI与OBI的统称[2],即HBsAg阳性产妇所生新生儿24 h静脉血中HBsAg阳性或HBV DNA载量≥200拷贝/ml;②DBI:HBsAg阳性产妇所生新生儿24 h静脉血中HBsAg阳性者;③OBI:HBsAg阳性产妇所生新生儿24 h静脉血中HBsAg阴性,但HBV DNA载量≥200拷贝/ml,或者新生儿在全程接种HBIG和3针乙肝疫苗后外周静脉血中HBsAg阴性,但HBV DNA载量≥200拷贝/ml;④HBV宫内未传播(NBIT):新生儿外周血检测HBsAg和HBV DNA均为阴性。
(7) 相关定义:①孕早期出血:孕1~13周,出现的阴道出血,血液多呈咖啡色或鲜红色;②孕晚期出血:孕28周后的阴道出血;③抗病毒治疗:为了降低HBsAg阳性孕妇发生婴儿感染风险,临床上对HBV DNA载量>2×106拷贝/ml或具有HBsAg阳性家族史或既往子代感染HBV指征的孕妇建议抗病毒治疗,建议在怀孕24~28周开始口服替诺福韦或替比夫定,并于分娩前检测HBV DNA;④乙肝疫苗接种:乙肝疫苗全程需接种3针,免疫程序为0-1-6个月,即接种第1针疫苗后,间隔1、6个月分别接种第2、3针疫苗,每针疫苗接种20 μg;⑤ HBIG注射:目前仍在一些医院允许在孕期使用HBIG用于预防HBV宫内感染,一般用于孕晚期,于孕28、32及36周肌肉注射HBIG 200 IU或每月1次(200 IU/次),使用3~5次;具体剂量依据检测HBeAg状态、孕妇主观要求而定。
3.质量控制:调查员和实验员统一培训,调查表采用双录入并随机抽取10%进行重复测量,发放问卷28份,通过Kappa系数法一致性检验分析,Kappa值为0.99,表明本次调查信度较好。实验检测均设有阴阳性对照、空白对照,并随机抽取30%进行复测,通过Kappa系数法一致性检验分析,乙肝五项ELISA检测结果Kappa值为0.98;HBV DNA载量检测结果Kappa值为0.94,IFN-γ检测结果Kappa值为0.89,IL-12检测结果Kappa值为0.83。表明本研究检测结果可信度较好。
4.统计学分析:采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料方差齐者采用t检验,方差不齐者采用t检验,计数资料采用χ2检验。相关影响因素采用多元线性回归分析估计相关因素与IFN-γ和IL-12的线性关联强度。把握度(1-β)=0.08,检验水准α=0.05,双侧检验。
结果1.研究对象和BIT情况:HBsAg为阳性的产妇282例及其所生新生儿285例,产妇年龄(29±3.49)岁,HBsAg及HBV DNA均为阴性的正常产妇对照组43例,年龄(28±5.00)岁。2组社会人口学特征均衡可比(P>0.05)(表 1)。根据新生儿乙肝五项和HBV DNA检测发现:21例HBsAg为阳性者,HBsAg阴性新生儿中HBV DNA载量≥200拷贝/ml者116例,即该人群发生DBI率、OBI率和BIT率分别为7.37%(21/285)、40.70%(116/285)和48.07%(137/285)。
2.不同BIT分组产妇外周血的IFN-γ、IL-12水平比较:对照组IFN-γ水平低于HBsAg阳性产妇组(P=0.011)、NBIT组(P=0.012)和OBI组(P=0.021),除DBI组外,其他组差异均有统计学意义;对照组IL-12水平显著高于HBsAg阳性产妇NBIT组(P=0.040)和DBI组(P<0.001)(表 2)。
3.不同HBV感染特征的产妇外周血中IFN-γ、IL-12状况:HBsAg阳性产妇HBV感染特征包括:HBeAg和HBV DNA载量,①对照组的IFN-γ水平显著低于HBsAg阳性产妇的HBeAg阴性组和HBeAg阳性组(P<0.05),对照组的IL-12水平显著高于HBsAg阳性产妇的HBeAg阴性组(P=0.038);②HBV DNA载量按103拷贝/ml、106拷贝/ml为截点分组,各组IFN-γ水平均高于对照组,除103~106拷贝/ml组外,其他差异均有统计学意义(P<0.05),103~106拷贝/ml组中DBI组IFN-γ水平显著低于OBI组和NBIT组(P<0.01),除103~106拷贝/ml组外,其他组的IL-12水平显著低于对照组(P<0.05)(表 3)。
4. HBsAg阳性产妇孕期干预情况与IFN-γ、IL-12水平的关系:除接种乙肝疫苗组外,其他组均呈现IFN-γ水平显著高于对照组(P<0.05),注射HBIG组中随着BIT程度的加重,其IFN-γ含量明显减少(P=0.041);抗病毒治疗组中随着BIT程度的加重,其IL-12含量明显减少(P=0.012),尤其DBI组IL-12水平显著低于NBIT组(P=0.048),NBIT组中抗病毒治疗组IL-12水平显著高于未治疗组(P=0.028),未注射HBIG组中DBI组IL-12水平显著低于NBIT组(P=0.044)(表 4)。
5. HBsAg阳性产妇各因素与IFN-γ、IL-12水平多因素分析:对母体的HBV感染血清学因素、妊娠过程中的暴露史以及新生儿出生时情况与IFN-γ、IL-12进行了相关分析,发现产妇IFN-γ水平与其年龄(P=0.035)、HBeAg(P=0.015)、乙肝疫苗注射(P=0.006)、HBIG注射(P=0.011)、抗病毒治疗(P=0.017)和前置胎盘(P=0.036)相关,IL-12与破膜方式相关(P=0.026),将相关因素列入回归模型(逐步法)进行多因素分析,排除了其他因素影响后结果显示,产妇年龄、前置胎盘和乙肝疫苗注射与母体IFN-γ水平的线性关系有统计学意义(P<0.05),破膜方式和乙肝疫苗注射与母体IL-12水平的线性关系有统计学意义(P<0.05)(表 5)。
讨论CD8+ T细胞是HBV感染模型中清除病毒最主要的效应T细胞,IFN-γ是CD8+ T细胞功能活化的指标,不仅可通过调节机体免疫反应来抑制HBV的合成,还可通过非溶细胞机制直接抑制HBV复制[3-5]。本研究发现HBsAg阴性对照外周血中IFN-γ水平低于HBsAg阳性产妇、NBIT组和OBI组,同时按HBsAg阳性产妇HBV DNA载量不同分组,各组IFN-γ水平均高于对照组,均提示HBV感染可以刺激孕妇体内IFN-γ的分泌,有利于其体内HBV的清除。同时本研究还显示对照组IL-12水平显著高于HBsAg阳性产妇NBIT、DBI和HBeAg阴性组,在HBsAg阳性产妇HBV DNA载量≤106拷贝/ml,随着病毒载量的升高IL-12水平呈升高趋势,但当HBV DNA载量>106拷贝/ml时,其IL-12水平则显著下降。慢性HBV感染的自然史包括免疫耐受、免疫清除和非活动病毒携带期组成,影响其炎症过程的主要因素是病毒相关的免疫反应环节。本研究人群是HBsAg阳性产妇,均为孕早期至分娩期间(>6个月)多次体检检测外周血血清HBsAg阳性者,可能处于慢性HBV感染的不同免疫反应期,而病毒持续感染可以导致幼稚T细胞减少,效应T细胞的数量增加,但其功能受到影响[6],本研究的IFN-γ和IL-12因子水平出现标准差变异较大的现象,这可能是慢性HBV感染过程中T细胞表达的细胞因子动态变化所致,进一步验证低载量的HBV可以刺激母体的Th1细胞分泌IL-12。当HBV DNA载量>106拷贝/ml时,DBI组IL-12水平在3组中呈现最低的现象,并且随着BIT发生的严重程度加重,其IL-12水平呈现递减趋势,即当HBV DNA载量升高>106拷贝/ml时,其体内IL-12水平呈现缺乏,高水平的IL-12很可能是BIT的保护因素,这与动物研究[7]中使用IL-12能够抑制HBV在肝脏的复制,达到阻断宫内感染的发生是一致的;同时HBV DNA载量103~106拷贝/ml组中DBI组IFN-γ水平也显著低于OBI组和NBIT组,本研究表象与有关研究提出Th1细胞免疫下调,是导致HBV宫内感染的主要原因之一相符[8],发现在不同情况下均存在母体IFN-γ、IL-12水平低下者更易发生BIT,但IL-12又受到产妇体内病毒载量高低的影响,表明其在宫内感染中发挥抗病毒能力的作用是受限的。
新生儿展开乙肝疫苗和HBIG联合阻断HBV母婴传播已全面推广,但仍有10%~20%的母婴传播阻断失败,国内外专家提出HBV宫内感染是新生儿出生后乙肝疫苗接种失败的主要原因,本研究HBsAg阳性产妇采取的干预措施有抗病毒治疗、注射乙肝疫苗和HBIG,研究发现注射HBIG组中呈现随着BIT程度的加重,其IFN-γ含量明显减少的趋势;抗病毒治疗组中呈随着BIT程度的加重,其IL-12含量明显减少的趋势,尤其DBI组IL-12水平显著低于NBIT组,未注射HBIG组中DBI组IL-12水平显著低于NBIT组,即无论哪种干预措施,发生DBI的产妇其IFN-γ、IL-12水平均发生明显下调。Th1型免疫反应能增强宿主抵抗微生物的感染,尤其是对免疫调节、抗肿瘤及抗感染等具有十分重要的作用,体内IFN-γ、IL-12的分泌是通过增加Th1型细胞的活化实现的[9],HBsAg阳性产妇的IFN-γ、IL-12下调导致其机体抵抗HBV感染能力下降,发生DBI的概率则增加;既往有研究提出诱导免疫细胞产生足够的IFN-γ,或可消除或逆转免疫耐受,从而达到更有效的免疫应答[10],本研究发现NBIT组中抗病毒治疗组IL-12水平显著高于未治疗组,提示抗病毒治疗可以增强HBsAg阳性产妇的Th1型免疫反应,刺激IL-12分泌。IL-12参与机体细胞免疫应答,纠正HBV引起的免疫紊乱,有利于母体内HBV的清除[11],有效降低了胎儿HBV感染率,这与本次研究结果相一致。因此,提高HBsAg阳性产妇体内的IFN-γ、IL-12水平有利于阻断DBI。
妊娠是一个复杂机体免疫过程,不同孕期、多种内外因素都会导致体内细胞因子的波动,本研究提示产妇年龄、前置胎盘和乙肝疫苗注射与母体IFN-γ水平相关,破膜方式和乙肝疫苗注射与母体IL-12水平相关。剖宫产、人工破膜作为一种手术干预手段,手术创伤必然导致机体应激性反应,致使母体增强免疫反应,诱导机体Th1细胞免疫应答,从而促进IFN-γ、IL-12炎性因子水平升高[12-13],因此,提示在深入研究时,可以扩大样本量将这些因素进行分层研究。
OBI不能等同于宫内感染,目前也尚未见OBI的临床相关报道,关于该领域研究目前属于摸索阶段。既往HBV宫内感染的研究无论是新生儿在1个月内还是7个月大,均以HBsAg检测呈阳性作为宫内感染的诊断标准,本研究中采用更精确的定义名称——“HBV宫内显性感染”,研究中OBI的判定源自于一般人群HBV隐匿性感染的发现和定义,其阳性的截断点在本研究中选用了一般人群OBI的判断标准,可能存在人群适用性的问题,也是本研究的局限性,需要我们展开后期的随访进一步为OBI的科学判定提供依据。
控制BIT是一项复杂而艰巨的任务,必须建立在摸清BIT内在机制的基础上才能获得正确有效的干预措施;本研究受样本量的限制以及孕产妇体内多种复杂因素影响,还需要扩大样本量进行分层研究,进一步确定各项细胞因子在高危产妇中的作用。据此,HBV在特定情况下可以激发孕产妇体内IFN-γ的表达,同时有限度地抑制IL-12的分泌,但是IFN-γ在HBsAg阳性产妇体内的表达呈现组内分化现象,在HBeAg阳性和高载量的环境下母体IFN-γ的水平会下降;控制HBV宫内感染的首要任务是增强孕妇细胞免疫,以减少体内病毒负荷量。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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