目前我国人群HBsAg阳性携带率高达6.1%^[1]，HBV垂直传播是重要传播途径之一^[2-3]。Toll样受体家族(TLRs)是天然免疫系统的重要组成部分，其中Toll样受体9(TLR 9)在固有免疫和获得性免疫中具有重要作用，与乙型肝炎(乙肝)的发生、发展、治疗及预后密切相关^[2]。本研究以HBsAg阳性产妇外周血和胎盘的TLR 9表达为监测目标，根据其新生儿HBV传播状况为结局，探讨母体TLR 9水平对胎儿HBV宫内传播(BIT)的影响作用，为探索BIT的预警指标提供参考依据。

1.研究对象：收集2015年1月至2017年6月经陕西省西北妇女儿童医院产前筛查HBsAg为阳性的产妇及其新生儿，产妇290例，新生儿291例。纳入标准：①HBsAg为阳性产妇；②所生新生儿在出生24 h内未接种乙型肝炎(乙肝)疫苗和卡介苗前采集静脉血者；③知情同意。

2.研究方法：采用病例对照研究方法，根据HBsAg阳性产妇的新生儿HBV感染结果判定，分为病例组与对照组，比较病例组HBsAg阳性与对照组HBsAg阴性产妇TLR 9水平的差别。

(1) 分组：采用两组均数比较的样本量估计方法，根据预实验数据求得相关参数：病例组(0.41±0.39)，对照组(4.14±8.42)，等比例分组，采用PASS 16.0软件计算病例组与对照组样本量各为43例。同期选择年龄匹配的45例健康产妇为对照组，纳入标准：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc(乙肝五项)及HBV DNA检测均为阴性结果。排除标准：①罹患其他感染性疾病；②未签署知情同意书。

(2) 问卷调查：统一制定流行病学调查问卷，主要内容：产妇的一般情况、家族史、本次妊娠史、孕期干预史以及生产情况和新生儿情况等。

(3) 标本采集：采集临产前的产妇及其新生儿(出生24 h内)未抗凝静脉血，新生儿需未接种乙肝疫苗和卡介苗前。分离血清，-20 ℃保存备用。采集产妇胎盘组织，10%福尔马林浸泡，蜡块包埋，切片备用。

(4) 血清HBV标志物检测：产妇及新生儿乙肝五项均采用ELISA法检测，操作和结果判定按试剂盒说明书(北京万泰生物药业股份有限公司)进行。HBV DNA载量采用PCR-荧光探针法检测，操作和结果判定按照试剂盒说明书(湖南圣湘生物科技有限公司)进行。

(5) 产妇外周血TLR 9检测：采用人TLR 9 ELISA试剂盒(北京方程生物有限公司)。检测均严格按照试剂盒说明书进行操作和判读结果。

(6) 胎盘组织TLR 9检测：鼠抗人TLR 9单克隆抗体(美国Imgenex公司)，鼠抗人HBsAg单克隆抗体(上海长岛生物技术有限公司)，免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。设立阴性对照：5例健康产妇足月胎盘组织；空白对照：以磷酸盐缓冲生理盐水代替一抗。Olympus DP70数码显微镜在相同条件下采集图片，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统中macro下的pathology宏批量检测TLR 9的累计光密度(integrated optical density，IOD)。

(7) 新生儿HBV感染结果判定：① BIT：HBV宫内显性感染(DBI)与HBV宫内隐匿性感染(OBI)的统称^[2]，即HBsAg阳性产妇所生新生儿24 h静脉血中HBsAg阳性或HBV DNA载量≥200拷贝/ml^[3]；②DBI：HBsAg阳性产妇所生新生儿24 h静脉血中HBsAg阳性者；③OBI：HBsAg阳性产妇所生新生儿24 h静脉血中HBsAg阴性，但HBV DNA载量≥200拷贝/ml，或者新生儿在全程接种乙肝免疫球蛋白(HBIG)和3针乙肝疫苗后外周静脉血中HBsAg阴性，但HBV DNA载量≥200拷贝/ml；④HBV宫内未传播(NBIT)：新生儿外周血检测HBsAg和HBV DNA均为阴性。

3.质量控制：调查员、实验员进行统一培训，采用双人双录入核对，随机抽取10%重复测量，发放问卷30份，通过Kappa系数法一致性检验分析，Kappa值为0.99，表明本次调查的信度较好。实验均设阴阳性、空白对照，并随机抽取30%进行复测，通过Kappa系数法一致性检验分析，乙肝五项ELISA检测结果Kappa值为0.99；HBV DNA载量检测结果Kappa值为0.91，TLR 9检测结果Kappa值为0.79，表明本次检测可信度较好。

4.统计学分析：采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。正态分布采用(x±s)描述，偏态分布采用M(P₂₅~P₇₅)描述。两组比较方差齐者采用t检验，方差不齐者采用Mann-Whitney U检验；多组比较方差齐者采用方差分析，方差不齐者采用非参Kruskal- Wallis检验。把握度(1－β)＝0.08，检验水准α＝0.05，双侧检验。

1.社会人口学特征和BIT情况：收集2015年1月至2017年6月经陕西省西北妇女儿童医院产前筛查的290例HBsAg为阳性产妇，年龄[(29±3.5)20~45]岁，45例健康产妇年龄[20~45(28±4.1)]岁，人口学特征见表 1。结果发现，291名新生儿中HBsAg为阳性者27例，HBsAg阴性新生儿中HBV DNA载量≥200拷贝/ml者117例，即该人群DBI、OBI和BIT率分别为9.28%(27/291)、40.21%(117/291)、49.48%(144/291)。

表 1 研究对象产妇及其新生儿一般情况

表选项

2. HBsAg阳性产妇及其BIT分组与对照组外周血中TLR 9水平比较：HBsAg阳性产妇外周血的TLR 9水平[290例，(2.41±4.48) pg/ml]显著低于HBsAg阴性者[45例，1.83(0.84~4.00) pg/ml](U＝4 457.00，P＝0.001)，其中NBIT组[146例，0.70(0.14~1.60)pg/ml]和OBI组[117例，0.74(0.14~1.60)pg/ml]均显著低于对照组(U＝1 825.00，P＝0.000；U＝1 672.00，P＝0.000)；NBIT组TLR 9水平显著低于BIT组[144例，1.21(0.28~4.31)pg/ml](U＝8 779.00，P＝0.015)；DBI组的TLR 9水平[27例，5.06(3.70~8.07)pg/ml]显著高于NBIT组[146例，0.70(0.14~1.60)pg/ml](U＝537.00，P＝0.000)和OBI组[117例，0.74(0.14~1.60)pg/ml](U＝475.00，P＝0.000)，随着BIT程度的加重，HBsAg阳性产妇外周血TLR 9含量呈增加趋势(χ²＝37.75，P＝ 0.000)(图 1)。

注：DBI：显性感染；OBI：隐匿性感染；BIT：宫内传播；NBIT：宫内未传播 图 1 HBsAg阳性产妇及各分组与对照组Toll样受体9(TLR 9)水平

图选项

3. HBsAg阳性产妇不同HBV感染状态下TLR 9水平状况：HBsAg阳性产妇HBV感染状态包括HBeAg和HBV DNA载量：①HBeAg：HBeAg阴性组产妇的TLR 9水平显著低于HBsAg阴性对照组(U＝2 795.00，P＝0.000)，HBeAg阳性组TLR 9水平虽然低于HBsAg阴性对照组，但差异无统计学意义(U＝69.50，P＝0.297)；每组按BIT程度分为：DBI、OBI和NBIT组，均随着BIT程度的加重，产妇TLR 9含量呈增加趋势(P＜0.01)；无论HBeAg阴性和阳性组，DBI组TLR 9水平均显著高于OBI组和NBIT组(P＜0.01)。②HBV DNA载量：按103拷贝/ml、106拷贝/ml为截点分3个层次，每层均随BIT程度的加重，其TLR 9含量呈增加趋势(P＜0.05)，每层中DBI组TLR 9水平均显著高于OBI组和NBIT组(P＜0.05)(表 2)。

表 2 HBsAg阳性产妇不同HBV感染状态下的TLR 9水平对比[pg/ml，M(P₂₅~P₇₅)]

表选项

4. HBsAg阳性产妇孕期干预情况与TLR 9水平的关系：DBI、OBI、NBIT组在抗病毒治疗、接种乙肝疫苗和注射HBIG各因素干预与未干预间TLR 9水平差异均无统计学意义(P＞0.05)。抗病毒治疗、注射HBIG和未接种乙肝疫苗组，均随着BIT程度的加重，产妇外周血TLR 9含量呈增加趋势(P＜0.05)，除注射乙肝疫苗组外，其他组别均呈现DBI组的TLR 9水平显著高于OBI组和NBIT组(P＜0.05)(表 3)。

表 3 HBsAg阳性产妇不同干预因素下TLR 9水平的对比[pg/ml，M(P₂₅~P₇₅)]

表选项

5.胎盘组织TLR 9检测情况：免疫组化显示，生理盐水缓冲液(PBS)对照组未见TLR 9棕黄色阳性信号，5例HBsAg阴性胎盘组织和15例HBsAg阳性胎盘组织(包括5例DBI组、5例OBI组和5例NBIT组)均能检测到TLR 9阳性信号，各组间方差分析呈现的差异有统计学意义(P＜0.05)，其中DBI组胎盘TLR 9表达强度明显强于HBsAg阴性胎盘组织、OBI组和NBIT组胎盘组织，其免疫组化累计光密度差异有统计学意义(P＜0.05)(表 4、图 2)。

表 4 HBsAg阳性产妇与对照组胎盘组织TLR 9检测情况

表选项

注：DBI：显性感染；OBI：隐匿性感染；NBIT：宫内未传播；PBS：生理盐水缓冲液 图 2 胎盘组织中TLR 9的免疫组化结果(×200)

图选项

既往研究发现约＞50%的HBV感染新病例是母婴传播引起的^[3]，本研究发现该HBsAg阳性产妇发生DBI率、OBI率、BIT率分别为9.28%、40.21%和49.48%，其中OBI是DBI的5.18倍，这部分人群可能是潜在乙肝疫苗无应答以及发生HBV母婴传播的高危人群，因此，对于BIT的预警监测研究不仅要包括DBI者，还要包括OBI者，才能实现全方位防控乙肝的目的。

表达于细胞器膜上的TLR 9在与细菌/病毒等DNA的非甲基化CpG为配体结合后有诱导凋亡的潜力^[4]。有研究认为慢性乙肝患者TLR 9的表达下调，诱导病毒持续感染或机会性感染明显增加^[5]。本研究发现HBsAg阳性产妇外周血的TLR 9水平显著低于HBsAg阴性产妇，其中NBIT组产妇和OBI组产妇均显著低于对照组，既往研究提出HBV的病毒核心dsDNA主要被TLR 9所识别，HBV感染能显著抑制TLR 9的表达^[6]，本研究结果与文献一致。

在病毒保护实验中发现通过激活TLR 9加强肝细胞的免疫应答能力，不但可以抑制HBV复制，还可能加快HBV在机体内的清除速度^[7]，本研究发现HBsAg阳性产妇随着BIT程度的加重，产妇外周血TLR 9含量呈增加趋势。不仅HBsAg阳性产妇中DBI组母体TLR 9均发生上调，随着BIT程度的加重，其TLR 9含量呈增加趋势，而且按HBV DNA载量10³拷贝/ml、10⁶拷贝/ml为截点分3个层次，每层均随着BIT程度的加重，其TLR 9含量呈明显增加趋势。有研究发现慢性重型乙型肝炎(CSHB)患者外周单核细胞(PBMCs)中TLR 9的mRNA表达比肝硬化患者明显增高，虽然CSHB患者PBMCs作为APC通过TLR 9途径呈递HBV抗原并提供第二信号刺激的能力受损，但通过PBMCs中B淋巴细胞代偿性上调TLR 9表达，增强了第二信号刺激，提示重症肝炎反而存在TLR 9上调表达的现象^[8]，本研究结果符合既往研究推论。BIT中胎盘是一个重要途径，在本免疫组化结果显示DBI的胎盘组织中TLR 9表达显著高于OBI组和NBIT组，和母体外周血的TLR 9表达水平一致。进一步佐证了在HBsAg阳性孕妇体内TLR 9水平呈增高的组内交叉分化现象，这为早期预测DBI提供了一个有效指标。

除注射乙肝疫苗组样本量太少外，其他干预组与未干预组呈现DBI组的TLR 9水平显著高于OBI组和NBIT组，并随着BIT程度的加重，产妇外周血TLR 9含量有明显增加趋势。进一步分析发现孕期抗病毒治疗和注射HBIG的孕妇皆为HBV DNA高载量或者HBeAg阳性者，其感染病情重于其他HBsAg阳性孕妇，推测发生BIT的母体由于体内HBV的活跃性高于NBIT组，可能存在刺激母体B淋巴细胞免疫应答，代偿性上调TLR 9表达，此研究结局符合既往研究结论^[8]。

综上所述，HBV一定程度上会抑制产妇体内分泌TLR 9，但HBeAg能刺激母体TLR 9分泌，随着BIT程度的加重，其体内TLR 9水平呈增高的组内交叉分化现象，因此，TLR 9不是一个能独立筛选分组的标记，但可以做为HBsAg阳性产妇监测管理的参考指标。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突