志贺菌为革兰阴性菌，兼性厌氧，对营养要求不高。根据生化反应和O抗原不同分为4个血清群(痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌)。痢疾主要通过与患者生活接触、污染的水源、食物及苍蝇等生物媒介传播。2017年9月13日，安徽省阜阳市某学校向阜阳市CDC报告，发现13日前后有多名学生出现发热、腹痛、腹泻，自述以稀便和水样便为主，有里急后重感。至2017年9月15日，发热或每天腹泻≥3次的病例共168例。本研究对此进行流行病学与病原学分析。

资料与方法

1.流行病学调查：该校为寄宿制，共80个班级、5 655名在校生，均为住宿生。学校唯一的食堂为承包制，学校周围有较多小吃店。该学校未接通市政供水，共有4口自备水井，1口270 m深水井用于全校的饮用水及部分生活用水，其余3口50 m浅水井用于部分生活用水。CDC接到报告的9月13日前10 d左右，阜阳市连续降雨，校内积水情况严重，排水困难，化粪池离浅水井很近，且浅水井蓄水池没有消毒措施。9月15日浅水井蓄水池消毒后，新发病例数呈逐渐递减趋势，9月20日后无新发病例出现。浅水井仅供应2、3、4、5号宿舍楼和教学楼的生活用水；深水井供应除2、3、4、5号宿舍楼外(1、6、7号宿舍楼、教学楼、行政楼、食堂)的生活用水及全校的饮用水。深水井水经纯水机过滤后为饮用水。发病病例全部为学生，教职工及食堂员工均无发热、腹泻或腹痛病例。截止9月15日各宿舍楼发病情况与供水来源见表 1。

2.样品来源与主要试剂仪器：采集样品共计88份：包括发热或腹泻患者的粪便5份，肛拭子33份；食堂厨师等工作人员肛拭子23份；学校食堂剩余食品11份；食堂案板、刀具、餐具等涂抹物样品4份；学生生活饮用水、宿舍饮用水12份。限制性内切酶XbaⅠ(日本TaKaRa公司)、仪器包括全自动微生物鉴定仪VITEK2(法国梅里埃公司)、脉冲场凝胶电泳仪及凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

3.病原检测与药敏试验：参照GB 4789食品卫生微生物学检验，对88份样品进行沙门菌、志贺菌与副溶血弧菌培养与系统生化鉴定，同时用荧光定量PCR方法检测沙门菌、志贺菌、诺如病毒与轮状病毒。

参照《国家致病菌识别网监测工作方案》推荐的最小抑菌浓度(MIC)法：吸取50 μl已经制备好的0.5麦氏单位菌悬液，加入1支12 ml M-H肉汤培养基内混匀后，注入测试板药敏孔，每孔100 μl。同时吸取无菌M-H肉汤培养基100 μl做阴性对照，36 ℃孵育18~20 h后判读结果。

4.毒力基因与分子分型：毒力基因检测将志贺菌划线接种LB平板36 ℃ 24 h，取单个菌落转种5 ml LB增菌液，36 ℃ 220 r/min震荡过夜培养，取4 ml菌液按照说明书提取DNA，取1 μl即为扩增模板。检测志贺菌ipaH、set1、sen和ial基因。扩增条件：94 ℃ 5 min；94℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。取5 μl扩增产物进行电泳。志贺菌4个毒力基因的检测引物及产物大小见参考文献[1]。

PFGE：制备16株志贺菌和沙门菌标准株(H9812)DNA胶块，用限制性内切酶XbaⅠ酶切，37 ℃ 3 h，电泳19 h，初始转换时间2.2 s，终末转换时间54.2 s，电泳后经染色拍照，采用BioNumerics 7.6软件分析PFGE电泳图谱。

多位点序列分型：采用adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA共7对管家基因引物进行扩增，志贺菌属7对管家基因引物序列、产物长度见参考文献[2]、电泳鉴定后送测序。双向测序结果使用Chromas及Seqman软件进行检验与拼接，以Mega软件截取比对序列。与Enterobase数据库中大肠埃希菌/志贺菌的管家基因进行序列比对，确定管家基因的等位基因编码，形成菌株ST型。

结果

1.一般情况：浅水井供水范围内宿舍楼的罹患率(3.41%)高于深水井(0.98%)，差异有统计学意义(χ²＝17.215，P＜0.001)。

2.病原检测与药敏试验：88份样品经过荧光定量PCR筛选，志贺菌阳性27份，沙门菌、诺如病毒和轮状病毒均为阴性。直接分离和增菌培养后检出志贺菌16株，经过血清凝集试验鉴定为宋内志贺菌Ⅱ相。见表 2。

16株宋内志贺菌对氨苄西林、四环素、复方新诺明、头孢唑啉、头孢噻肟、庆大霉素、萘啶酸、阿奇霉素、链霉素高度耐药，且耐药谱高度相似。见表 3。

3.毒力基因与分子分型：16株宋内志贺菌，ipaH基因均阳性、set1基因均阴性、sen和ial基因同时阳性7株，携带率43.75%。16株宋内志贺菌PFGE经过XbaⅠ酶切图谱相似度100%(图 1)。

16株宋内志贺菌ST型均为ST152。将Enterobase数据库宋内志贺菌的全部ST型作最小生成树^[3]，ST152为绝对优势ST型(图 2)。

讨论

结合病原结果及临床症状可以判定，这是一起由宋内志贺菌引起的细菌性痢疾暴发。浅水井与本次暴发存在关联。本次调查未能在水源方面追溯到病原，考虑与水样采集有关，一是未采集井水，二是浅水井所供生活用水采样数目偏少，建议有类似情况标本种类采集齐全、数量充分，以便为溯源提供依据。本次暴发分离出的16株宋内志贺菌PFGE带型相同，支持病原为同一来源的可能。

志贺菌是引起肠道感染的主要病原，我国以B群福氏志贺菌为主。安徽省淮北市、马鞍山市近年来流行的志贺菌均为福氏志贺菌，宋内志贺菌占比较低。2007－2013年淮北市从监测点腹泻病例中分离志贺菌215株，其中福氏志贺菌占94.42%，宋内志贺菌占5.58%^[4]。2005年马鞍山市分离的67株志贺菌中，福氏志贺菌占71.64%，宋内志贺菌占28.36%^[5]。但近年来宋内志贺菌腹泻逐渐增多，有多起因污染饮用水^[6]、污染食品^[7]引起的宋内志贺菌腹泻暴发。

毒力基因和耐药方面，本研究与2008－2010年安徽省分离的20株宋内志贺菌较为相似。20株宋内志贺菌ipaH、sen、ial基因均为阳性，set1基因均为阴性^[8]，其中ipaH基因、set1基因分布与本研究一致，sen和ial基因略有差别。这可能与携带这些基因的质粒丢失有关。

细菌耐药已经在世界范围内受到临床和公共卫生领域越来越多的关注，尤其是多重耐药现象日益严重^[9-10]。本次暴发的宋内志贺菌对磺胺类、大环内酯类耐药，部分四环素类、三代头孢类、氨基苷类耐药，与安徽省20株宋内志贺菌相似^[8]；对复方新诺明、四环素、萘啶酸均耐药，未显示肠道菌常用抗生素喹诺酮类耐药，与国内报道基本一致^[11]。

多位点序列分型显示本次宋内志贺菌ST型均为ST152，为世界范围内的优势型别，提示该型别具有非常广泛的传播力。2017年中国陕西省3起志贺菌疫情的型别均为ST152型^[12]，1983－2014年巴西圣保罗宋内志贺菌的ST型也均为ST152型^[13]。

分子生物学方法可以快速筛选出目标基因，而传统培养可以进一步分析其耐药性和同源性。本研究采用传统培养和分子生物学方法相结合，为快速处置与疫情分析，指导临床用药及进一步的分子生物学研究，提供了科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突