中华流行病学杂志  2019, Vol. 40 Issue (7): 864-869   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2019.07.024
中华医学会主办。
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潘海西, 黄秋芳, 任雅楠, 邢文革.
Pan Haixi, Huang Qiufang, Ren Yanan, Xing Wenge.
HIV-2检测方法学进展
Progress in HIV-2 detection methodology
中华流行病学杂志, 2019, 40(7): 864-869
Chinese journal of Epidemiology, 2019, 40(7): 864-869
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2019.07.024

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收稿日期: 2018-12-20
HIV-2检测方法学进展
潘海西1 , 黄秋芳1 , 任雅楠2 , 邢文革2     
1. 南宁市疾病预防控制中心 530023;
2. 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心, 北京 102206
摘要: 实验室检测是HIV感染的诊断、监测和血液筛查的常规方法,是艾滋病早期诊断的主要依据。HIV分为HIV-1和HIV-2,HIV-1广泛分布全球各地,是造成全球艾滋病流行的主要原因,HIV-2主要分布于非洲西部,流行较为局限。我国从1998年陆续有HIV-2感染的报道,多为散发病例,绝大部分都是HIV-1/HIV-2混合感染。目前我国针对HIV-2检测的关注较少,国产可区分HIV-2的检测试剂也没有注册上市。目前HIV-2的检测方法主要是抗体检测和核酸检测,通过快速检测等方法进行初筛检测,免疫印迹试验(WB)和条带免疫试验(LIA)进行确认,依据HIV抗体检测结果确定是否感染HIV-2。随着分子生物学技术的飞速发展,核酸检测实验室诊断方法取得了很大进展。
关键词: HIV-2     检测     方法学    
Progress in HIV-2 detection methodology
Pan Haixi1 , Huang Qiufang1 , Ren Yanan2 , Xing Wenge2     
1. Nanning Municipal Center for Disease Control and Prevention, Nanning 530023, China;
2. National Center for AIDS/STD Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Corresponding author: Xing Wenge, Email:xingwenge@sina.com
Abstract: Laboratory test is the routine method of diagnosis, monitoring and blood screening of HIV infection, and main basis for early diagnosis of AIDS. HIV is divided into HIV-1 and HIV-2 subtypes, HIV-1 infection is the major cause of AIDS pandemic, while HIV-2 infection occurs in limited areas in the world, mainly in West Africa. HIV-2 infection has been reported in China since 1998. They are sporadic cases, and mainly HIV-1/HIV-2 mixed infections. There are less concerns about HIV-2 detection in China at present, and domestic HIV-2 detection reagents have not come into the market. At present, the detection method of HIV-2 is mainly antibody test and nucleic acid test. The initial screening is through rapid test and other methods and the confirmation is depended on Western Blot and Line Immune Assay. According to the HIV antibody test results, HIV-2 infection is confirmed. With the rapid development of molecular biology, the diagnostic method of nucleic acid detection laboratory has made great progress.
Key words: HIV-2     Test     Methodology    

截至2018年7月31日,全国报告现存活HIV/AIDS 831 225例,报告死亡255 995例[1]。HIV分为HIV-1和HIV-2,其中HIV-1是引起全球艾滋病流行的病原体,其致病性强,传播快速,病程进展快。相对HIV-1感染者来说,HIV-2感染者的疾病进展缓慢[2],CD4+T淋巴细胞计数(CD4)下降缓慢[3-4],性传播和垂直传播低[5-6],低病毒载量[7-8],对非核苷酸类反转录酶抑制剂和几种蛋白酶抑制剂天然耐药,而这些药物是HIV-1的基础治疗药[9-10]。HIV-2是1980年代中期从西非的艾滋病患者中分离出的病原体,其他地区陆续有个例报道,转而蔓延到整个非洲、欧洲、印度和美国等[11]。目前,全球估计有100万至200万HIV-2感染者[11-12],与HIV-1在全球的传播相反,HIV-2在很大程度上仍然局限于非洲西部的一些国家[13]。经济全球化带来的人口流动增加也使HIV-2得以传播[14-17]。我国1998年首次在福建省发现HIV-2感染者[18],随后陆续在湖南省[19]、广州市[20]、宁夏回族自治区[21]、云南省[22]等有报道,多为散发病例并呈点状分布。我国病例绝大部分是HIV-1和HIV-2混合感染,主要是来自于HIV-2流行地区或者曾经在HIV-2流行区并有过高危行为。HIV-2的超微结构及细胞嗜性与HIV-1相似。在分子学特性方面,HIV-2与猴免疫缺陷病毒(SIV)相近,与HIV-1的结构蛋白差异较大,尤其是外膜蛋白。其核苷酸和氨基酸序列与HIV-1相比明显不同,仅40%~50%与HIV-1相似[23]。HIV-2基因组也有gagenvpol 3个基因编码结构蛋白,gag编码核心蛋白p55、p26、p16;env基因编码包膜蛋白gp125/105a及gp36/41,pol基因编码反转录酶、内切核酸酶和蛋白酶p68、p34、p53。也有tatrevnefvifvpr等调控基因和辅助基因。所不同的是HIV-2没有vpu基因,而是在其中央区有一个vpx基因编码病毒蛋白x,其功能尚不清楚。HIV-2的抗原特性与HIV-1不同,两者的结构蛋白交叉反应最强,而外膜蛋白交叉反应最弱。目前HIV-2检测方法主要包括抗体检测和核酸检测,抗体检测又包括筛查检测和确证检测。筛查检测有快速检测、ELISA和化学发光等;确认检测包括免疫印迹试验(WB)和条带免疫试验(LIA)。核酸检测包括HIV-2 RNA和HIV-2 DNA检测,本文主要对这些检测方法进行阐述。

一、抗体检测

1.筛查检测:

(1)快速检测:HIV快速检测方法,使用比较简便,不需要专业的实验室技术人员和实验室设备,一般15~30 min可以读取结果,这种方法和技术对临床医生非常重要[24]。在艾滋病诊断策略中,除个别的正在血清转化的个体无法快速检测外[25-26],≥2种的快速试剂诊断已经用于诊断标准。快速检测的缺点主要是产品质量相差较大、不宜质控,只能定性不能定量,只作为初筛的诊断试剂。对HIV-1和HIV-2感染者进行准确分型和采用合适的抗病毒治疗至关重要。

(2)免疫层析试验:是一种用免疫层析原理的快速检测,以醋酸纤维膜为载体,HIV抗原线状固定在膜上,定性测定血样的HIV抗体。加样品入反应条,如果样品中有HIV抗体,将会与膜上抗原结合,被固相包被的合成肽和重组抗原所捕捉,形成一条红线。如果样品中不含HIV抗体,则没有一条红线形成。目前,常用的可区分HIV-1和HIV-2的免疫层析法快速试剂有:①日本产Determine HIV-1/2 assay试剂;②韩国产SD Bioline HIV 1/2 3.0试剂;③法国产GenieⅡHIV1/HIV2试剂;④英国产Immunoflow HIV-1/HIV-2试剂;⑤印度产First Response HIV Card Test 1-2.0试剂。

Chaillet等[27]在几内亚用443份HIV阳性标本(其中384份HIV-1、52份HIV-2和7份混合型)对SD Bioline HIV1/2 3.0、GenieⅡ HIV1/HIV2、Immunoflow HIV-1/HIV-2、First Response HIV Card Test 1-2.0这4种试剂的评估结果显示,SD Bioline HIV 1/2 3.0、Genie Ⅱ HIV1/HIV2、Immunoflow HIV-1/HIV-2试剂检测HIV感染的敏感度为100.0%,First Response HIV Card Test 1-2.0试剂检测HIV感染的敏感性则为99.5%。对于区分HIV-1和HIV-2型,GenieⅡ HIV1/HIV2试剂可以区分99.5%的HIV-1、95.2%的HIV-2和HIV-1/2混合型,SD Bioline HIV 1/2 3.0试剂只能区分65.1%HIV-1和69.2%HIV-2标本,见表 1。对以上的4种试剂的评估认为Genie Ⅱ HIV1/HIV2试剂对区分HIV-1/2型是最好的,但是GenieⅡ HIV1/HIV2试剂的缺点是只能用血清或者血浆检测,不能用全血检测,且试剂需要在2~8 ℃保存,因此,在有实验室的条件下,可能是首选试剂,无实验室和冷链的条件下,使用Immunoflow HIV-1/HIV-2试剂更为合理。在几内亚农村地区,使用Immunoflow HIV-1/HIV-2试剂代替SD Bioline HIV 1/2 3.0试剂作为HIV分型的诊断试剂更合理。

表 1 4种HIV-1和HIV-2快速诊断试剂鉴别诊断准确性比较(%)

(3)免疫渗滤试验:免疫渗滤试验是快速检测的另一种方法,以醋酸纤维膜为载体,HIV抗原点状或线状固定在膜上,加入待测样品,利用微孔滤膜的可滤过性,使抗原和抗体反应。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点或条带,反应时间≤10 min。

Multispot HIV-1/HIV-2 Rapid Test是一种免疫渗滤法,是2004年11月被美国FDA批准的快速检测试剂,可在15 min内定性检测HIV-1和HIV-2抗体的免疫试剂,滤膜上包被有4个点,分别是质控对照抗人IgG,含有HIV-2 gp36主要免疫表位多肽,含有重组的HIV-1 gp41蛋白和HIV-1 gp41主要免疫表位的多肽[28]。有研究显示该试剂与WB检测结果有较高的一致性。Ramos等[17]的研究显示,经过第3或第4代ELISA试剂筛查出的993份有反应的样品中,用Multispot HIV-1/HIV-2 Rapid Test试剂进行复核,有反应890例,无反应的103例样品中有10例证实为HIV-1急性感染期;882例显示HIV-1反应并用WB确认后,871例显示HIV-1抗体阳性,11例显示HIV抗体不确定的有6例最终结果判为HIV-1感染。3例显示HIV-2有反应,5例显示HIV-1和HIV-2均有反应,但HIV-1和HIV-2显示的颜色深浅有差异,最后判定结果见表 2

表 2 8例HIV-2有反应的最终判定结果

(4)ELISA法:基本原理是免疫反应物通过化学或免疫学的方法形成酶结合物,酶结合物能与待检样品中相应的抗原或抗体结合成为免疫复合物,然后加入酶底物,经酶的催化或水解作用,无色底物产生颜色,用肉眼、分光光度计观察结果。初筛用的ELISA试剂目前已经发展到第4代检测试剂。第1代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。随着基因工程技术迅速发展,1990年5月第2代使用基因重组或合成多肽抗原的HIV诊断试剂面试。虽然仍然是利用间接酶联免疫法原理,但第2代诊断试剂窗口期比第1代诊断试剂缩短了约20 d,灵敏度和特异性也有所提高。同时由于第1代试剂只含有HIV-1抗原,而HIV-1抗原与HIV-2抗原的核苷酸序列相差约40%[23],因此检测HIV-1抗体的试剂对HIV-2抗体阳性的标本灵敏度较低,常发生漏检,针对此种情况第2代诊断试剂中出现了HIV-1/HIV-2抗体诊断试剂盒,这种试剂盒在包被的抗原中又加入了HIV-2抗原(gp36多肽),使得在1次试验中可同时检测HIV-1和HIV-2抗体。第2代试剂与第1代相比,特异性有明显的提高。第3代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。第4代HIV诊断试剂是一种HIV-1/HIV-2抗体与HIV-1 O亚群抗体及p24抗原的联合检测方法。近年来为节省时间和经费,大部分试剂厂家和血库采用HIV-1和HIV-2抗体联合测定。联合测定的ELISA模式与HIV-1抗体测定相同,不同的是在包被固相载体时用HIV-1和HIV-2这2种抗原的混合物替代单一的HIV-1抗原。

(5)化学发光免疫分析:根据其采用的标记物不同可分为发光物标记、酶标记、元素标记化学发光免疫分析3大类。化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。发光物标记的CLIA是以发光物质、酶标记物作为标记物标记重组HIV的gp120、gp41和合成肽gp36抗原或抗体,在化学发光反应体系(如金刚烷胺增敏化学发光反应体系作为底物)中发光物质在碱性介质中氧化时释放大量自由能,产生激发态的中间物质由最低振动回到稳定基态,产生辐射,从而产生发光现象。利用发光信号的测量仪器,分析接受光量子产额,通过计算机系统转换成被测物质的浓度单位。此系统包括两部分:化学发光反应系统和免疫反应系统,即HIV抗原抗体特异性反应过程中,伴随有化学反应过程而产生光的发射现象,其光量子强弱代表检测HIV抗体是阳还是阴。目前HIV化学发光试剂都是HIV-1/HIV-2抗体联合检测试剂,当实验显示阳性反应时,待进一步用确证试剂进行血清学确证。

2.确证试验:HIV-2抗体的WB法主要分为两类:WB法和条带免疫试验(Line Immuno Assay,LIA)[29]。国内常用的确认试验方法是WB。确认流程:有HIV-1/2混合型和单一的HIV-1或HIV-2型,先用HIV-1/2混合型试剂进行检测,如果无反应,则报告HIV抗体阴性,如果有反应,则报告HIV-1抗体阳性,如果不满足阳性标准,则判为HIV抗体检测结果不确定。如果出现HIV-2的特异性指示带,需要用HIV-2型WB试剂再做HIV-2的抗体确认,无反应,报告HIV-2抗体阴性,呈有反应性则报告HIV-2抗体血清学阳性。WB的敏感性一般不低于初筛实验,但其特异性很高,这主要是基于HIV不同抗原组分的分离以及浓缩和纯化,能够检测针对不同抗原成分的抗体,因而能够用WB方法鉴别初筛实验的准确性。

目前所有的确证试剂盒均包被合成肽gp36抗原,均可检测到HIV-2,但不是所有的试剂盒都能区分HIV-1和HIV-2。主要用于HIV-2确认的试剂盒有:①INNO-LIA HIV-Ⅰ/Ⅱ Score(Innogenetics,比利时),检测可区分HIV-1和HIV-2。②NEW LAV BLOT Ⅱ(Bio-Rad,法国)。③HIV BOLT 2.2和HIV BOLT 1.2(Genelabs Diagnostic,新加坡),HIV BOLT 2.2可以混合检测HIV-1和HIV-2,HIV BOLT 1.2为HIV-2确证试剂盒。④HIV-1/2 LIA-PEPTI-LAV 1-2(Bio-Rad,法国),也可同时检测并区分HIV-1和HIV-2抗体。⑤2017年国家食品药品监督管理总局注册批准条带免疫试剂MIKROGEN recomline HIV-1 & HIV-2 IgG(德国,国械注进20173407220),此试剂可同时确认HIV-1和HIV-2。所有的试剂盒操作步骤和结果判定均按试剂盒说明书。以上的试剂盒虽然可以单独检测到HIV-2,但由于其与HIV-1在氨基酸水平上的同源性为40%~50%,进行确证实验时可能会出现交叉反应[30]。按照我国目前诊断HIV感染的常规检测程序,对于HIV-2感染,即使HIV-2抗体阳性,也只能报告血清学阳性,只有经过核酸分析后才能确证为HIV-2感染[31]。在我国许多可疑HIV-2感染的样本绝大部分同时呈现HIV-1阳性[29]

二、核酸检测

1. HIV-2 RNA检测:HIV-2感染与HIV-1感染有显著不同,主要表现在其自然过程缓慢、治疗方式不同和遗传多样性。因此,分子诊断方法是患者监测所必需的。目前的检测方法主要由实验室自建方法或商业试剂盒的衍生产品组成,在其敏感性、准确性和对HIV-2基因多样性的覆盖率方面受到严重限制[32]。HIV-2感染的特征之一是血浆中病毒载量低,法国有研究显示在974例HIV-2感染者中,61%未治疗者的血浆病毒载量<250拷贝数/ml。英国有研究表明当CD4>500个/μl时只有8%检测到RNA,CD4<300个/μl只有62%的病例可以检测到血浆的病毒载量[33]。当前,临床上尚未有批准注册的商品化HIV-2 RNA试剂盒。有报道显示HIV-2值在不同的实验室检测结果差异较大[32]。HIV-2高度变异性,基因分型可分为A~H共8组亚型。其中A组是最常见[15],其次是B组[34]。Avettand-Fenoel等[35]进行了前瞻性研究,他们选择放大LTR和GAG区域的双重方法,策略基于病毒基因组两个不同区域的引物和探针的耦合,已被罗氏诊断公司在其CAP CTM HIV-1检测2.0版中采用,还使用了与Biocentric HIV-1检测试剂盒相同的操作条件。新的试验呈良好的线性关系(40~1 000 000拷贝数/ml),内部重现性(<15%)。通过对3个不同地点的评价,验证了其实验室的可重复性。对手工和自动提取方法进行了验证,以确保与资源有限的国家尝试中的本地实践相兼容。该分析方法可以在相同的分析平台上使用,也可以用于检测HIV-1,从而提高其用于监测感染了HIV-1和/或HIV-2患者的成本效率。这种同时分析的可能性将有助于母婴传播的HIV-1和/或HIV-2诊断,也有助于诊断和跟踪同一样本中的HIV-1/HIV-2双重感染。并且,使用该方法进行HIV-2的病毒性监测,将为了解不同临床阶段HIV-2感染的自然史提供新的见解。

日本建立了一种定性的实时PCR检测HIV-1和HIV-2 RNA的方法[36]。从500 μl血浆中提取病毒RNA,用小沟聚合物探针进行实时PCR检测。以牛白血病病毒为内标,敏感性采用WHO对HIV-1和HIV-2的国际标准进行概率回归分析。HIV-1和HIV-2最低检测限分别为54 IU/ml和5.0 IU/ml,这比其他报道的任何HIV-2检测方法都低。在52份HIV-1阳性标本中检测到51份HIV-1 RNA,10份HIV-2阳性标本中检测到7份HIV-2 RNA。在100份HIV阴性标本中未检测出HIV-1和HIV-2之间的非特异性信号和交叉反应,该方法对检测HIV-1和HIV-2具有高度的敏感性和特异性,有助于对HIV-1和HIV-2感染的诊断。但该研究的局限性:①HIV-2阳性血清的样本量较少;②无HIV-1和HIV-2共感染的标本;③本研究未对HIV-2 B亚型进行检测,因为所有检测到的HIV-2 B亚型核苷酸序列与用于实时PCR的正反引物和探针核酸序列一致的。

使用HIV-2 RNA对HIV-2感染诊断存在较大的争议,因为将近一半的患者体内并未能检测到HIV-2 RNA[37]。人们普遍认为在HIV-2感染中,前病毒DNA比病毒RNA更容易检测到。

2. HIV-2 DNA检测:在血液中检测不到HIV-2 RNA的情况下,HIV-2 DNA可能是唯一检测的标记物。在血清学交叉反应强的情况下,HIV-2 DNA可能是诊断HIV-2单感染或/和HIV-1共感染的标志物[38]。HIV-2 DNA的检出对母婴传播的早期诊断至关重要,另外,HIV-2 DNA可用于发病机制的研究。

当前,还未有HIV-2 DNA商品化的定量试剂盒问世,以前已有多种HIV-2 DNA的定量检测研究,但均对HIV-2 B亚型病毒检测的质量较难以控制,而有些标本中也无法检测到HIV-2 DNA[39]。为建立一种可复制的、灵敏度和特异性高度HIV-2 DNA检测方法,特别是对高流行的A和B亚型进行实时定量检测,Bertine等[40]开展了前瞻性研究,在美国3个实验室进行开发和验证实验,评估方法的分析性能和实验室的可重复性,对50份HIV-1阳性标本、30份HIV阴性标本和63份HIV-2阳性标本进行实验检测,结果敏感性和特异性均为100%。这种定量的分析方法是基于一种针对长末端重复(LTR)和gag基因保守一致区域的三重Taqman PCR方法,该方法已用于HIV-2 RNA定量分析[35]。该项研究的目的是建立一种高敏感性的HIV-2 DNA定量检测方法,能在HIV-2流行地区易于实施。虽然HIV-1和HIV-2之间存在广泛的基因突变,但HIV-2引物并不与HIV-1基因杂交。实验结果显示具有良好的线性关系(6~6 000拷贝数/PCR),实验室的可重复性良好。此外,该实验方法还包括定量检测的外部标准,这可以提高研究的可靠性和相互之间的比较,这种新的HIV-2 DNA病毒载量的测定方法,具有良好的分析性能和临床敏感性,特别是成功检测到HIV-2 A和B亚型,最后此方法在一大批特征良好的患者标本上得以印证。它对于HIV血清学阳性母亲新生儿的HIV-2诊断和/或HIV-1单独感染或合并感染也特别有用,对监测和治疗后果非常重要,它还可以帮助研究HIV-2储存库的发病机制,目前认为评价储存库的唯一可行的临床指标是外周血HIV DNA,可以有效地解决在目前有效治疗的情况下,HIV感染者普遍检测不到HIV RNA,缺乏有效的指引困惑。HIV-2 DNA还可以探索不同阶段HIV-2感染的自然史,并为治疗的患者提供更多的临床研究机会。

综上所述,本文分别从抗体检测和核酸检测方面,对HIV-2实验室检测技术及其发展进行综述,抗体的筛查检测快速方便,但产品质量相差较大,不宜质控,只能定性不能定量。HIV抗体确证实验可确定是否感染HIV-2,但由于HIV-1和HIV-2在血清学上有很大的交叉反应,很多病例出现了HIV-1特异性条带后就忽略HIV-2特异性条带,容易造成对HIV-2的漏检。核酸的检测具有很高的灵敏度,对疾病的进展检测,治疗效果的观察和耐药监测非常重要。由于HIV-2的基因多样性,没有一套引物可以覆盖所有的HIV序列,使检测的敏感性受到限制。此外,目前还没有商品化的试剂盒上市,检测方法没有标准化,实验室间检测结果重现性差,成本高,操作人员要求高,难以在一般实验室推广,不适用于快速检测与临床广泛应用。如何在提高检测灵敏度与特异性的同时,达到快速检测、操作自动化和降低成本的目的,更好地为我国艾滋病防控工作服务,将是HIV-2检测技术的未来发展方向。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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