宫颈癌的发生发展是一个非常复杂的过程，需要经历多因素、多阶段、多步骤的长期作用。高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）持续感染是全球公认的宫颈癌发生的主要病因^[1-2]，育龄妇女中HR-HPV感染现象普遍存在，但大部分都是一过性感染^[3]，仅小部分最终进展为宫颈癌^[4]，提示在宫颈病变的发生发展过程中，还存在着其他重要的致癌因子及协同作用因子^[5-6]。多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一类广泛存在于环境中的有机污染物，可直接通过人体的呼吸道、消化道、皮肤等被吸收，具有致畸、致癌、致突变的作用。国内外大量研究显示，PAHs与肺癌、膀胱癌、前列腺癌、阴囊癌、皮肤癌等多种癌症密切相关^[7-8]，然而关于PAHs暴露与宫颈癌关系的研究甚少。虽然细胞学研究显示暴露于高浓度苯并（a）芘[B（a）P]可增加HR-HPV的感染强度或感染持久性^[9-11]，HR-HPV感染的存在可能增加B（a）P诱导机体突变的风险^[12]，但基于人群的相关研究目前尚未见报道。本研究旨在探讨PAHs暴露与HR-HPV感染在宫颈上皮内瘤变发生发展过程中的作用及其交互效应，以期为宫颈上皮内瘤变病因学的研究提供理论依据，为宫颈上皮内瘤变预防和干预措施的制定提供新思路。

1.研究对象：从课题组在山西省阳曲县建立的自然人群队列中，选取2014年6－12月经病理学确诊的正常宫颈（NC）妇女208例、低度宫颈上皮内瘤变（CINⅠ）患者154例和高度宫颈上皮内瘤变（CIN Ⅱ/Ⅲ）患者124例为研究对象。均为已婚且≤65岁且在阳曲县居住1年以上的汉族女性，排除妊娠期妇女、有子宫切除术史者、有宫颈及阴道病变治疗史者、其他恶性肿瘤患者以及精神病患者。

2.资料收集：本研究经山西医科大学伦理委员会审查，在研究对象知情同意的基础上，采用结构式调查问卷收集研究对象的一般人口学特征、生殖情况、生活习惯、既往病史等资料。收集全部研究对象的宫颈脱落细胞及晨尿，置于-80 ℃冰箱贮存待检。所有尿样于3个月内完成检测。

3.实验方法：

（1）尿中1-羟基芘（1-hydroxypyrene，1-OHP）浓度测定：采用高效液相色谱法检测研究对象尿中1-OHP浓度，并用尿肌酐进行校正。主要步骤：取2 ml尿样，加入0.6 g/ml氢氧化钠溶液500 μl，避光水解4 h；加入20 μl内标标准工作液，调节pH值至3~5；加入二氯甲烷萃取，45 ℃吹氮浓缩至近干，用流动相溶解。尿样的定性分析采用与混合标准品保留时间对比的方法进行。1-OHP保留时间为7.2 min，内标咔唑的保留时间为4.3 min。采用内标法进行定量分析，以1-OHP标准溶液浓度为横坐标，1-OHP与内标咔唑的峰面积之比为纵坐标，绘制标准曲线。计算尿中1-OHP的浓度（μg/L），实际浓度（pmol/L）＝检测浓度（μg/L）×10⁶/10/218（g/mol）。采用饱和苦味酸法测定尿中肌酐含量，1-OHP肌酐校正后浓度（μmol/molCr）＝1-OHP实际浓度（pmol/L）/肌酐测定浓度（μmol/L）。

（2）导流杂交技术检测HPV感染状态：采用HPV-DNA提取试剂盒及21种HPV分型检测试剂盒（潮州凯普生物化学有限公司）进行HPV分型检测。主要步骤：取800 μl含有宫颈脱落细胞的细胞保存液，按试剂盒说明书处理样品、提取宫颈脱落细胞中的DNA。按PCR-Mix 23.25 μl、Taq酶0.75 μl、DNA模板1 μl配制成25 μl /人份扩增反应体系并混匀，取5 μl抽提的DNA样品进行PCR扩增，每批次同时扩增阳性对照和阴性对照各1份。利用导流杂交平台，在已经固定好核酸探针的低密度基因芯片上杂交、显色。根据膜条HPV分型分布图判定相应点的HPV类型，本研究将HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68阳性确定为HR-HPV感染。

4.统计学分析：采用SPSS 22.0软件建立数据库，定性资料采用χ²检验、χ²趋势检验，定量资料采用Kruskal-Wallis H检验、Nemenyi秩和检验，两变量间关系采用Spearman秩相关分析，因素与疾病间关联强度指标选用OR值及其95%CI，应用相加效应模型及交互作用相对超额危险度（RERI）、归因危险比（API）和交互作用指数（S）进行交互作用定性和定量评估。检验水准α＝0.05。

1.人口学特征及相关因素分析：NC组、CIN Ⅰ组、CIN Ⅱ/Ⅲ组年龄中位数（年龄范围）分别为50（25~65）、49（24~64）、45（27~65）岁。各组在职业、文化程度、婚姻状况、出生地、居住地、吸烟、饮酒、饮茶、性生活后清洗阴部、经期性生活、痛经、首次生育年龄、人工流产史、避孕措施、既往慢性病史、家族肿瘤史等方面均衡可比（P＞0.05），但在年龄构成、被动吸烟、首次性交年龄、绝经、清洗阴部频率方面的差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表 1 研究对象人口学特征及相关因素分析

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2. HR-HPV感染与宫颈上皮内瘤变的关系：各组HR-HPV感染率的差异有统计学意义（χ²＝31.71，P＜0.001）。CIN Ⅱ/Ⅲ组HR-HPV感染率高于NC组，调整影响宫颈上皮内瘤变相关因素后其差异仍有统计学意义。随着宫颈病变的进展，HR-HPV感染率呈逐渐升高趋势（趋势检验χ²＝29.89，P＜0.001），见表 2和图 1。

表 2 高危型人乳头瘤病毒感染与宫颈上皮内瘤变的关系

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注：NC为正常宫颈组；CINⅠ为低度宫颈上皮内瘤变组，CINⅡ/Ⅲ为高度宫颈内瘤变组；1-OHP为1-羟基芘；HR-HPV为高危型人乳头瘤病毒 图 1 尿1-OHP浓度和HR-HPV感染与宫颈病变的关系

图选项

3. PAHs暴露与宫颈上皮内瘤变的关系：经Kruskal-Wallis H检验，各组1-OHP浓度的总体分布不全相同（H＝76.36，P＜0.001）。采用Nemenyi秩和检验进行组间两两比较显示，任意两组尿中1-OHP浓度的差异均有统计学意义。进一步以NC组1-OHP浓度的P₅₀点值（0.07 μmol/molCr）为界分为高暴露与低暴露进行定性分析显示，CIN Ⅱ/Ⅲ组尿中1-OHP高暴露率高于NC组，调整影响宫颈上皮内瘤变相关因素前后差异均有统计学意义。随着宫颈病变程度的加重，尿中1-OHP浓度及高暴露率均逐渐升高（表 3和图 1）。

表 3 尿1-OHP浓度（μmol/molCr，M±Q_R）与宫颈上皮内瘤变的关系

表选项

4. PAHs暴露与HR-HPV感染在宫颈上皮内瘤变中的关系：采用Spearman秩相关分析尿中1-OHP浓度与HR-HPV感染的关系。结果显示，1-OHP浓度与HR-HPV感染呈正相关（r＝0.680，P＜0.001）。调整影响宫颈上皮内瘤变相关因素后偏相关系数仍有统计学意义（r＝0.649，P＜0.001）。

5. HR-HPV感染与PAHs暴露在宫颈上皮内瘤变中的交互作用：以NC组为对照，以该组1-OHP浓度的P₅₀值为界，应用相加效应模型分别进行CIN Ⅰ和CIN Ⅱ/Ⅲ交互作用分析及交互指标的计算。结果显示，在CIN Ⅱ/Ⅲ组中，HR-HPV感染与PAHs高暴露呈相加交互作用，交互作用指标RERI、API均显示正相加效应，在调整影响宫颈上皮内瘤变相关因素后这种效应依然存在，但在CIN Ⅰ中未发现存在类似交互作用（表 4）。

表 4 高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染与多环芳烃暴露在宫颈上皮内瘤变中的交互作用

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本研究显示，NC、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ/Ⅲ组妇女HR-HPV感染率的差异有统计学意义，且随着宫颈病变程度的加重而逐渐升高，提示HR-HPV感染与宫颈上皮内瘤变，特别是与高度宫颈上皮内瘤变的发生密切相关，而后者进展为宫颈癌的风险极大^[13]。因此，在已婚妇女中开展HPV的分型筛查，尤其是对HR-HPV阳性者进行更为精细的宫颈病变检查，对于早期发现宫颈癌变，真正将宫颈癌变的预防关口前移具有重要意义。

PAHs作为公认的致癌物质，其进入机体后，在CYP4501A1的作用下代谢生成7，8-二羟基-9，10-环氧苯并（a）芘（BPDE）。BPDE容易与DNA共价结合形成BPDE-DNA加合物，引起DNA损伤^[14]。尿中1-OHP浓度是反映人体PAHs内暴露剂量的一种敏感性较高、特异性较强的生物标志物，被广泛用于评价人体PAHs的内暴露情况^[15]。本研究显示，CIN Ⅰ、CIN Ⅱ/Ⅲ组尿中1-OHP浓度均高于NC组，且随着宫颈病变程度的加重而逐渐升高，尤其是对高度宫颈上皮内瘤变的影响更为显著，提示PAHs高暴露与宫颈上皮内瘤变，特别是高度宫颈上皮内瘤变的发生密切相关。

B（a）P是第一个被发现的环境化学致癌物，常作为PAHs的代表，细胞学研究显示，HPV16阳性的宫颈上皮永生化细胞及正常宫颈上皮细胞同时暴露于45 mCi/mmol的B（a）P 24 h后，前者P53蛋白的表达水平较后者低，HPV感染细胞可能通过降低P53蛋白表达从而增加B（a）P引起机体突变的风险^[12]。HPV DNA与宿主基因整合后可能引起E2基因失活，E6，E7基因表达上调^[16-17]，后者编码的E6，E7蛋白能与P53蛋白、Rb蛋白特异性结合。P53蛋白在DNA损伤后的DNA修复和凋亡中发挥着重要的作用^[18]，P53蛋白水平的下降可能导致PAHs引起的DNA损伤得不到及时的修复，增加机体突变的风险。Alam等^[9]研究显示，在HPV31阳性的宫颈细胞中，暴露于高浓度B（a）P的细胞HPV31的病毒滴度是暴露于低浓度组的10倍，B（a）P暴露还可增加HPV16和HPV18感染细胞的病毒滴度，B（a）P可能通过调控HPV的生命周期增强病毒的持续感染。Bowser等^[10]进一步研究发现，在HPV31阳性细胞中，B（a）P通过激活细胞ERK1/2信号通路，活化p90RSK以及下游目标CDK1，增加病毒滴度，而在CDK1特异性抑制剂purvalanol A存在的条件下，产生的是不具有传染性的HPV31b病毒颗粒，提示HPV31b的合成依赖于B（a）P介导的CDK1激酶的激活^[11]。然而，关于PAHs暴露与HR-HPV感染在宫颈病变中关系的研究目前仅局限在细胞学实验，基于人群的相关研究目前尚未见报道。本研究基于人群资料分析PAHs暴露与HR-HPV感染在宫颈上皮内瘤变中的关系，结果显示，HR-HPV感染率与尿中1-OHP浓度呈正相关，且在高度宫颈上皮内瘤变中存在正相加交互作用，HR-HPV感染和PAHs高暴露同时存在时所致CIN Ⅱ/Ⅲ的患病风险是其他因子所致风险的3.37倍，其中有69%的患病风险可归因于HR-HPV感染与PAHs高暴露产生的交互效应。提示PAHs高暴露可能增加HR-HPV的感染强度或感染持久性，而HR-HPV感染也可能增加PAHs诱导机体突变的风险。

本研究从群体角度揭示了PAHs高暴露可增加宫颈上皮内瘤变的患病风险，提示PAHs高暴露与HR-HPV感染在高度宫颈上皮内瘤变发生发展中存在协同作用。尿中1-OHP浓度虽然是反映PAHs暴露最客观及最常用的指标，但1-OHP的浓度仅能反映人体对芘的暴露水平，后期尚需同时检测尿中1-羟基萘、2-羟基萘、2-羟基芴浓度等暴露指标及血中BPDE-DNA加合物等效应指标全面准确反映人体PAHs的暴露情况，以期更为全面和客观地评价PAHs的暴露水平。