HBV显性感染的常规判定标准为HBsAg检测阳性，目前常用的检测方法有ELISA、电化学发光免疫法（ECLIA）、时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）及化学发光免疫分析法（CLIA）等。其中ELISA常用于HBsAg定性检测，而灵敏度更高的ECLIA可用于定量或半定量检测^[1]，但对于两种方法检测结果不一致样本的判定还存在疑问，其中仍可能存在HBV DNA阳性样本。母婴传播是HBV感染的主要途径^[2-4]，因此对孕妇人群HBV感染判定的准确性尤为重要，且直接影响新生儿接受乙型肝炎疫苗的免疫策略^[5]。为此本研究建立孕妇队列，采用ELISA和ECLIA两种方法检测HBsAg，评价两者的一致性及其影响因素，分析不同阳性组别HBV S基因片段分子进化特征。

招募2014年1月1日至2015年1月31日安庆市市立医院收住的所有分娩孕妇，其中分娩活产儿的孕妇为研究对象。排除标准为非活产（包括流产、引产、死胎等）、拒绝参与本研究及血标本量不足的孕妇。共纳入住院活胎分娩孕妇2 296例。

通过医院电子病历信息系统取得入院临床记录，本研究自拟调查问卷收集孕妇人口学等资料。并在知情同意下，于孕妇入院后第2天，抽取外周静脉血5 ml：室温静置约1 h后，以4 000 r/min离心15 min，吸取足量的上清液置于灭菌Eppendorf管，双管（A、B）分装，置-80 ℃保存备检。孕妇血清A管使用ELISA和ECLIA进行HBsAg平行检测。ELISA检测结果判定按试剂厂家说明书规定的Cut-off值作为判断标准，夹心法检测HBsAg S/CO≥1.0为阳性。ECLIA检测HBsAg阳性的判断标准为结果值＞0.05。对所有B管血清采用天根生化科技（北京）有限公司生产的TIANamp Virus DNA/RNA Kit试剂盒（批号：DP315），严格按操作说明书抽提DNA，储存于-20 ℃备检。使用巢式PCR检测HBV S和pre S片段，阳性结果需不同实验室和不同操作者再次重复实验，结果仍为阳性者确认为阳性，本实验室HBV S和pre S片段PCR扩增灵敏度分别为118~1 180拷贝/ml和11.8~118拷贝/ml。

统计分析采用SPSS 19.0软件。定量资料采用M和四分位间距（QR）；定性资料的比例比较使用Pearson χ²检验或行×列表χ²检验或Fisher确切概率法或Possion检验，对其中三组总体不全一致的进行四格表χ²检验或Fisher确切概率法两两比较，并采用Bonferroni校正。定量指标比较使用Kruskal-Wallis秩检验，对其中三组总体不全一致的进行Mann-Whitney检验两两比较，并采用Bonferroni校正。所有P值均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 296例孕妇标本中，ELISA检出164例阳性，阳性率为7.1%；ECLIA检出227例阳性，阳性率为9.9%。两种方法检测一致率为95.4%，Kappa＝0.71，两种方法的一致性程度较高（表 1）。以ECLIA为确证法计算，ELISA灵敏度为63.0%，特异度为99.0%。按不同的人口学特征分组，两种方法检测结果比较均为ECLIA优于ELISA。依据ELISA和ECLIA检测HBsAg阳性结果，分为ELISA单阳组、ELISA和ECLIA双阳组以及ECLIA单阳组，分析显示三组孕妇在年龄、孕周及婚姻状况的差异无统计学意义；ELISA单阳组与ECLIA单阳组比较，在年龄和居住地的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

表 1 ELISA和ECLIA检测HBsAg结果的比较

表选项

表 2 HBsAg不同检测方法阳性组孕妇人口学特征

表选项

共获得HBV S基因片段序列123条，进化树见图 1。其中B基因型113条（91.7%），C基因型10条（8.3%）；adw2血清型112条（91.1%），adw3血清型1条（0.8%），adr血清型10条（8.1%）。两种方法检测不同基因型病毒株，结果显示B基因型的差异有统计学意义（P＜0.05），C基因型的差异无统计学意义；检测不同血清型的结果显示，adw2血清型差异有统计学意义（P＜0.05），adw3和adr血清型差异均无统计学意义（表 3）。ELISA单阳、ELISA和ECLIA双阳以及ECLIA单阳组间基因型与血清型分布的差异无统计学意义。

图 1 HBsAg阳性孕妇HBV S基因片段分子进化树

图选项

表 3 两种方法检测孕妇不同基因型或血清型HBV病毒株的比较

表选项

因C基因型HBV株数少，故只分析B基因型。结果显示两种方法检测不同变异位点的差异均无统计学意义。分析HBsAg不同阳性组别序列变异，总体核苷酸和氨基酸位点替换率的差异无统计学意义[ELISA单阳组，核苷酸为3.7‰即12/（6×544），氨基酸为8.3‰即9/（6×181）；ELISA和ECLIA双阳组，核苷酸为4.0‰即172/（80×544），氨基酸为6.6‰即95/（80×181）；ECLIA单阳组，核苷酸为2.5‰即36/（27×544），氨基酸为7.4‰即36/（27×181）]，P＞0.05。共95个位点发生核苷酸替换，ELISA单阳组、ELISA和ECLIA双阳组及ECLIA单阳组分别出现10、81和26个；三组间核苷酸替换率的差异无统计学意义。共49个位点发生氨基酸替换，ELISA单阳组、ELISA和ECLIA双阳组及ECLIA单阳组分别出现8、40和16个；主要亲水区（MHR）99~169位的氨基酸共16个位点发生非同义替换（表 4），其中ELISA单阳组和ECLIA单阳组未在任一相同位点出现替换（图 2）。三组间氨基酸替换率的差异无统计学意义。

表 4 HBsAg阳性孕妇不同检测组HBV S基因病毒株主要亲水区核苷酸和氨基酸替换情况

表选项

图 2 HBV基因B型ELISA单阳组与ECLIA单阳组病毒株MHR氨基酸替换比较

图选项

本研究发现ELISA和ECLIA检测孕妇HBsAg具有高度的一致性，但两种方法检测HBV病毒株B基因型和adw2血清型结果的差异有统计学意义，均为ECLIA优于ELISA。B基因型病毒株进化分析显示，两种方法检测氨基酸或核苷酸替换位点的差异无统计学意义，但ELISA单阳组和ECLIA单阳组在MHR第110~160位出现完全互补的氨基酸替换位点。

既往研究显示ELISA与ECLIA检测HBsAg均有较好的一致性^[6-8]。本研究采用ELISA初步检验，阳性者采取ECLIA复测，结果阳性则判定为阳性，若阴性则判定为假阳性。然而发现在ELISA单阳组，即“假阳性组”和ECLIA单阳组分别仍存在28.6%和33.3%的HBV DNA阳性率。因此本研究进一步探讨不一致性可能的分子差异。

现有的HBsAg检测技术主要是基于α抗原决定簇的抗原抗体反应而建立，α抗原决定簇位于HBsAg的MHR内，是第124和147位氨基酸间的蛋白三级结构。本研究未发现两种方法检测结果或不同阳性组别在MHR的核苷酸或氨基酸替换位点的差异有统计学意义。持续性HBV DNA阳性也可呈现为OBI，是血清学HBsAg检测为阴性的HBV感染，即出现检测逃避^[9]；OBI病毒株中报道较多的MHR变异有G145R、P120T、I/T126N/A、Y161F等^[10-11]，本研究所获得的病毒株出现相同的变异有T126A和Y161F。Huang等^[12]研究发现，OBI病毒株发生在MHR的C124R、C124Y、K141E以及D144A位点变异可以显著降低常见HBsAg检测试剂的灵敏度（包括本研究所使用的试剂盒），本研究中ELISA和ECLIA单阳组所获得的病毒株未出现相同的位点变异，提示其可能不具有OBI病毒株的明显特征。

将ELISA和ECLIA两单阳组比较发现，在MHR第110~160位出现完全不重叠的氨基酸替换位点，即两种方法可以识别不同的变异位点，提示该两种方法同时使用可能更准确的检出HBsAg阳性感染者，从而降低该两组感染者在孕妇中可能造成的静默传播和母婴传播。

本研究存在不足。如无HBV DNA定量检测结果，无法更好阐述两种方法的一致性程度。基于本研究是大样本队列分析结果，故建议临床检验应合并使用ELISA和ECLIA检测，以防控孕妇人群HBV感染保障母婴健康。