致泻性大肠埃希菌（DEC）目前仍是导致感染性腹泻的主要病原^[1]，依其毒力因子、致病机制及遗传学特性主要分为肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC，或产志贺毒素大肠埃希菌，STEC）、产肠毒素性大肠埃希菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）和肠集聚性大肠埃希菌（EAEC）^[1-2]。由于DEC的鉴定方法比较复杂，一般常见的方法包括毒力基因鉴定和血清学分型，但全套鉴定血清非常昂贵，且目前缺乏较为全面的血清型数据，而已有的数据表明部分DEC菌株无法采用血清学分型，两种方法分型结果常常不一致^[3-4]，为此本研究依托浙江省腹泻症候群病原谱监测网络的菌株库，对2009年7月至2013年6月4年间DEC菌株开展血清学分析，探索血清分型方法的鉴定效率，以期为DEC的鉴定和防控提供借鉴。

1.菌株：来自2009年7月至2013年6月浙江省腹泻症候群病原谱监测网络菌株库中的696株DEC菌株（分离自3 712例门诊腹泻患者的粪便标本），其中分离自杭州地区389株（55.9%），其余地区307株（44.1%）。按分离时间计，3－5月72株（10.3%）、6－8月454株（65.2%）、9－11月101株（14.5 %）、12月至翌年2月69株（9.9%）。有161株DEC菌株（23.1%）源于≤18岁患者，395株（56.8%）源自19~59岁患者，140株（20.1 %）来源于≥60岁患者；364株（52.3%）源于男性，332株（47.7%）源于女性。

2.实验方法：

（1）毒力基因鉴定：粪便标本按照常规微生物培养的方法接种，从每个MAC平板上分别挑取5个乳糖发酵的可疑大肠埃希菌菌落，分别保存于半固体菌种管，每月定期转种于血平板，37 ℃培养16~20 h，刮取第一区细菌采用煮沸法提取DNA，多重PCR筛查DEC，对毒力基因阳性的样本采用相应的引物进行单重PCR复核。目的基因包括escV、bfpB、stx1、stx2、elt、estIa、estIb、invE、astA、aggR和pic，引物序列、扩增体系、扩增参数和结果判读参照文献[5]。引物合成和PCR产物测序均由上海生工生物工程技术有限公司完成，PCR试剂购于TaKaRa公司。

（2）血清型鉴定：挑取菌种，血平板分离，（36±1）℃培养过夜，采用DEC常见的O多价、O单价、H诊断血清进行血清凝集试验，操作严格按照说明书进行。O和H诊断血清包括O群血清78种，H群血清22种，其中O血清为O1、O26、O86a、O111、O119、O127a、O128、O44、O55、O125、O126、O146、O166、O18、O114、O142、O151、O157、O158、O6、O27、O78、O148、O159、O168、O20、O25、O63、O153、O167、O8、O15、O115、O169、O28ac、O112ac、O124、O136、O144、O29、O143、O152、O164、O74、O91、O103、O121、O145、O161、O165、O2、O45、O7、O9、O14、O16、O21、O51、O66、O71、O73、O75、O76、O77、O80、O83、O85、O88、O101、O104、O113、O118、O123、O129、O137、O139、O149、O175；H血清为H2、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11、H12、H16、H18、H19、H20、H21、H27、H28、H34、H40、H41、H42、H45、H51。诊断血清购于日本生研株式会社（前50种O血清和全部H血清）和丹麦血清研究所（后28种O血清）。部分菌株在生理盐水中自凝，以“O rough”表示。“O-”或“H-”表示菌株对全部O血清或H血清未凝集。

3.统计学分析：采用Excel 2007软件进行数据整理和分析，依据《感染性腹泻诊断标准》（WS 271-2007）中DEC血清学鉴定分类方法^[2]，对毒力基因和血清学分类的结果进行比较。

1.毒力基因分布：根据毒力基因鉴定分类方法，696株DEC中EAEC 408株（58.6%），ETEC 180株（25.9%），EPEC 92株（13.2%），EHEC 14株（2.0%），EIEC仅1株（0.3%），另有1株同时携带EAEC和ETEC的毒力基因。EAEC菌株的毒力基因astA、aggR和pic均可单独或全部存在，也可两两组合，其中84.6%的EAEC携带astA。78.6%的EHEC携带stx2，21.4%携带stx1，57.1%的EHEC携带escV（LEE毒力岛），未发现同时携带stx1和stx2的菌株（表 1）。

表 1 浙江省696株DEC毒力基因和和血清型分布

表选项

2.血清群和型分布：所有DEC中有288株（41.4%）能明确O抗原型别，另有16株自凝（O rough），分属于35种O血清群。171株（24.6%）H血清凝集（其中62株O血清未凝集），分属于21种H型，其余菌株O血清和H血清均未发生凝集。居首位的血清型为O6：H16（21株，其中4株为EAEC，17株为ETEC）和O159：H34（20株，全部为ETEC）。常见O血清群为O159（43株，6.2%）、O6（43株，6.2%）、O148（28株，4.0%）、O45（25株，3.6%）、O25（22株，3.2%）和O15（21株，3.0%）；H血清群常见的为H16（31株，4.5%）、H34（25株，3.6%）、H18（16株，2.3 %）、H2（16株，2.3%）和H41（14株，2.0%）。

EAEC O血清凝集率为31.9%（130/408），分属于30种O血清群，其中36.9%集中在O6（17）、O15（16）和O45（15）；ETEC凝集率为70.6%（127/180），分属于18种O血清群，其中75.8%集中在O159（39）、O6（25）、O148（23）和O25（13）；EPEC凝集率为31.5%（29/92），分属于15种O血清群，其中O45和O1分别有8株和5株；14株EHEC中仅2株凝集，1株为O157：H7，另1株为O1群（表 1，2）。

表 2 浙江省696株DEC血清学凝集率和血清学鉴定分类

表选项

3.毒力基因鉴定和血清学分类结果的比较：根据《感染性腹泻诊断标准》（标准）中的血清学分类方法，本研究仅能对75株（10.7%，75/696）DEC分类，其中ETEC 40株、EAEC 28株、EPEC 6株和EHEC 1株。75株中有42株（56.0%）经毒力基因检测方法分类结果和血清学分类结果一致，33株（44.0%）不一致（表 2）。其中可分类的40株ETEC中有36株血清学分类仍为ETEC（O159：H34、O148：H28、O169：H-和O27：H7）。33株不一致的菌株中有29株毒力基因鉴定为EAEC，4株为ETEC，但血清学分类多为EPEC（图 1）。

注：EPEC为肠致病性大肠埃希菌，EHEC为肠出血性大肠埃希菌，ETEC为产肠毒素性大肠埃希菌，EIEC为肠侵袭性大肠埃希菌, EAEC为肠集聚性大肠埃希菌；图中每一个圆代表 1种血清型（下划线表示该血清型均有不一致区和相一致区），括号内数据为菌株数；左半圆表示毒力基因鉴定结果，右半圆表示血清群/型鉴定结果，颜色相同代表两种鉴定方式相一致，反之则不一致；3株O28ac：H-根据毒力基因分类，2株为EAEC、1株为ETEC，3株为O128：H-；O20：H-根据血清学鉴定依据可分为EPEC或ETEC 图 1 75株可通过血清学分类的DEC血清型分布

图选项

目前临床实验室针对腹泻患者一般仅开展霍乱弧菌、沙门菌和志贺菌病原学筛查，少数实验室开展副溶血弧菌和大肠埃希菌O157：H7的鉴定，但未对DEC其他型别开展筛查。实际上，DEC引发的肠道感染在肠道病原谱中构成比超过了志贺菌和沙门菌，成为婴幼儿和成年人腹泻重要致病菌^{[1, 6]}。本课题组发现浙江地区门诊腹泻患者DEC的检出率为18.8%，远远超过传统常规筛查的病原检出率，其中以EAEC、ETEC和EIEC为主，EHEC和EIEC较少见。通过多重PCR方法检测DEC的毒力基因进行分类，是目前病原监测实验室常用方法^{[3-4, 6]}，具有灵敏、简便、成本较低等特点。

及时了解各类DEC的血清型分布特征，特别是地区流行的主要优势型别，是传染病预防控制的重要内容。浙江地区DEC的血清群以O159、O6、O148、O45、O25和O15较常见，而泰国以O15、O25、O86a和O126为主，我国台湾地区常见的血清群为O1、O8、O15、O25和O44^[7-8]。本研究发现EAEC和EPEC的O血清群相对较多样化，而ETEC则相对集中。不同类型DEC可具有同一血清群/型，O125：H21、O15：H18、O25：H42、O45：H2、O6：H16和O86a：H34均在两类DEC中出现，若以O血清群计，交叉现象则更显著。

依据标准，DEC的鉴定分类的步骤包括：取新鲜粪便标本接种选择培养基培养，再从平板上挑取可疑菌落作革兰染色镜检、生化试验并开展血清凝集以初步鉴定，然后根据不同DEC类别开展毒素测定、细胞黏附试验或者毒力基因等检测^[2]。由于标准中只有部分优势血清群/型可作为筛查依据，同时多价血清覆盖范围较窄、全套血清昂贵并难以获得，这种依赖血清凝集的鉴定方式繁琐且低效，漏检率极高，但这种诊断方法目前仍被推荐并采用。本研究仅41.4%的DEC能明确O抗原型别，24.6%能明确H抗原型别。EAEC、ETEC、EPEC的O血清凝集率分别为31.9%、70.6%和31.5%，14株EHEC中仅2株凝集，1株为O157：H7。曲梅等^[3]对北京地区262株DEC研究发现仅有19株能明确O抗原型别；深圳市74株DEC中有63.5%能明确O抗原型别^[4]；高翔等^[9]也发现24株EPEC中仅2株能被诊断血清凝集。本研究中696株经毒力基因检测方法鉴定为DEC菌株进行血清学分析，仅75株能被分类，其中33株毒力基因和血清学分类不一致。这些研究结果反映了各类DEC的优势血清群/型可能发生改变，或者有更多的血清群/型类别的菌株存在，因此单纯通过血清学筛查DEC，会造成极大的漏检或误分。

本研究存在缺陷。尽管研究中采用的常见DEC诊断血清种类相对较多，但还不够全面，这在一定程度上影响了血清凝集率；另外，按照总课题推荐方法，对分离的大肠埃希菌直接进行毒力基因筛查，再对阳性菌株进行血清学分析，未同时依据标准直接采用多价血清开展初步鉴定，因此对血清学鉴定效率的判定存在一定局限。

综上所述，研究提示浙江地区DEC血清群/型种类多样，单纯通过血清学筛查DEC会造成极大的漏检或误分，建议采用分子生物学方法鉴定毒力基因的方式鉴定DEC，必要时进行血清学调查。