文章信息
- 郑霄, 王鲁茜, 吴华, 陈海, 朱雄, 贺金荣, 夏连续, 李伟.
- Zheng Xiao, Wang Luxi, Wu Hua, Chen Hai, Zhu Xiong, He Jinrong, Xia Lianxu, Li Wei.
- 类鼻疽伯克霍尔德菌跨洲际流行株的同源性分析及历史溯源
- Homology analysis and historical tracing for inter-continental Burkholderia pseudomallei strains of sequence type 562
- 中华流行病学杂志, 2017, 38(5): 661-664
- Chinese Journal of Epidemiology, 2017, 38(5): 661-664
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2017.05.021
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文章历史
收稿日期: 2016-10-15
2. 102200 北京市昌平区疾病预防控制中心应急办公室;
3. 570311 海口, 海南省人民医院检验科;
4. 572000 三亚市人民医院检验科
2. Emergency Office, Changping District Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102200, China;
3. Department of Laboratory, Hainan Provincial People's Hospital, Haikou 570311, China;
4. Department of Laboratory, Sanya People's Hospital, Sanya 572000, China
类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,类鼻疽伯克菌)引起的一种热带感染性疾病,呈世界性分布,东南亚及澳大利亚北部是全球已知的两个主要流行区[1]。类鼻疽伯克菌常通过破损皮肤、呼吸道、消化道等途径感染人和动物,其污染的土壤、水体等是类鼻疽病的感染源。以往研究表明,受地理分隔等因素影响,两大流行区的类鼻疽伯克菌种群相互分离、遗传特征差异明显[2]。依靠序列型(ST)等遗传标志可判别菌株来源(东南亚/澳大利亚)[3]。然而,新近发现ST562菌株在我国台湾地区、海南省及澳大利亚北部地区大规模流行[4],打破了以往的洲际界限,其原因及来源未明。目前已完成基因组测序的类鼻疽伯克菌350105菌株[5](1976年分离自我国海南省环境)及澳大利亚流行株MSHR5858[6](2011年临床分离株)同为ST562序列型,为了解此型菌株的来源及传播史提供了重要线索。为明确ST562相关疫情性质及历史菌株与流行菌株间的遗传关系,本研究通过生物信息学方法分析了测序基因组中限制性酶切指纹、数目可变串联重复序列(VNTR)多态性等遗传学特征,并与海南ST562序列型流行株的分子分型结果进行比较。
材料与方法1.菌株:不同年代、来源的ST562序列型类鼻疽伯克菌共7株(表 1)。SY44、HN003、HN061、HPPH43、HPPH48流行株分离自海南省3所医院(三亚市人民医院、海南省人民医院、海口市人民医院)近年收治的类鼻疽患者(2008年1例,2012、2015年各2例),均为本实验室保藏;MSHR5858株分离自2011年澳大利亚达尔文市1例类鼻疽患者[6];历史菌株350105由军事医学科学院于1976年自海口市环境样品中分离[5]。菌株350105(CP012093、CP012094)及MSHR5858(CP008891、CP008892)已完成基因组测序,序列自NCBI的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)下载。
2. ST562海南流行株的分子分型:对5株海南临床分离株进行PFGE分析。实验方法、所用内切酶(SpeⅠ)及电泳参数见参考文献[7]。以标准菌株Salmonella enterica serotype Braenderup H9812为分子量标尺,采用BioNumerics 5.0软件(比利时Applied Maths公司)进行图像处理及同源性比对。采用Bart等建立的多位点可变数目串联重复序列多态性分析(MLVA-4)分型方案[8],即首先提取菌株染色体DNA,然后进行4个VNTR位点(2341k、1788k、933k、389k)的PCR扩增。PCR产物送北京天一辉远生物技术有限公司进行毛细管电泳,根据GeneScan 500 LIZ Size Standard(美国ABI公司)确定扩增产物长度。通过产物长度计算各VNTR位点的重复次数,获得MLVA-4指纹谱。
3.测序菌株分子遗传特征的提取:
(1)SpeⅠ限制性片段指纹谱:将基因组序列输入Vector NTI 11.0软件(美国Invitrogen公司),并对其SpeⅠ酶切位点及限制性片段注释;注释完成后的限制性片段按长度排序整理成指纹谱,用于与PFGE限制条带进行比对。
(2)MLVA-4指纹谱:参照MLVA-4分型方案中的引物序列,通过DNAstar 6.0软件提取基因组中4个VNTR位点(2341k、1788k、933k、389k)的等位序列,然后根据已定义的重复序列确定其重复次数,获得MLVA-4指纹谱。
4.基因组共线性比对:采用Sanger研究所的基因组序列比对工具WebACT[9](http://www.webact.org/WebACT/generate)比较澳大利亚流行株MSHR5858与我国海南省历史菌株350105基因组序列的共线性及同源性;同时描述(C+G)百分含量等基因组特征。
结果1.海南ST562流行株分子分型及与澳大利亚流行株比对:5株海南ST562型临床分离株PFGE结果见图 1。所有菌株PFGE带型基本一致,相似度为97%~100%。以H9812为分子量标尺,将海南流行株的PFGE限制条带(SpeⅠ酶切)与通过软件获得的澳大利亚流行株MSHR5858的SpeⅠ限制片段进行比对,可见两者限制性片段的数量相同(18条可见条带),大小接近,可相互对应。ST562流行株的MLVA-4指纹谱见表 1。其中5株海南流行株的MLVA-4指纹各不相同,呈多态性。澳大利亚流行株MSHR5858指纹谱(10,8,8,6)与海南流行株HPPH43指纹谱(10,8,10,8)相近:在2341k及1788k两位点出现相同重复数。
2. 350105株与MSHR5858株的分型指纹比对:350105株(海南省历史菌株)与MSHR5858株(澳大利亚流行株)的SpeⅠ限制片段指纹谱见表 2。2株菌的限制片段数分别为34和31。进一步比对发现,其中31个限制片段在2株菌中可一一对应;350105株中增加的3个片段分别为97 386 bp、17 540 bp及1 196 bp。由于PFGE难以分辨长度低于20 kbp的基因组片段,且以上结果已证实海南流行株与澳大利亚流行株的PFGE带型基本相同。由此推断,历史菌株(350105)与流行株MSHR5858的PFGE指纹仅存在单一条带(97 386 bp)的差异,相似度较高。MLVA-4指纹谱比对显示(表 1),海南历史菌株350105(11,8,11,8)与近期分离的海南流行株HK003(11,8,15,7)、HK061(11,8,17,7)在2341k、1788k两位点重复数相同。
3.基因组共线性分析:基于WebACT的历史菌株(350105)与流行株(MSHR5858)基因组同源比对结果见图 2。两基因组总长度分别为7 127 033 bp、7 072 128 bp;平均(C+G)含量均为68%。以350105株为参照,MSHR5858株基因组中大染色体长度减少了64 646 bp,同时小染色体长度增加了9 741 bp。两株的大、小染色体均具有良好共线性,共有基因(core genome)占绝大部分。同时发现,350105株大染色体817 470 bp处存在16 kbp插入序列(图 2),功能注释提示其编码多个整合酶(integrase)相关基因。
讨论类鼻疽病原菌的多位点序列分型(MLST)方案及互联网数据库使菌株间遗传特征的比对更为便利。然而,由于类鼻疽伯克菌易发生菌株间DNA重组,仅凭ST单一指标并不能确定菌株的来源相同。以往曾报道东南亚地区、澳大利亚有2个ST(ST105和ST849),分别对应1株澳大利亚分离株和1株缅甸分离株。但后经全基因组测序证实,2个ST的亚洲与澳洲分离株在基因组水平差异明显,并无同源性;ST型重合是菌株间基因组高频重组趋同效应导致的偶然现象,与跨洲际传播无关[10]。与上述2个ST型相比,ST562的菌株更多,时间、空间跨度更大。故在疫情调查前,应明确所有菌株是否同源,即是否发生了跨越不同地域、不同年代的传播。
本研究7株ST562的基因组限制性酶切指纹高度相似、高变VNTR位点重复数相同以及我国海南历史菌株与澳大利亚流行株在基因组水平高度同源等,均支持基于ST型的分离于不同年代、洲际的ST562菌株来源一致的推断,说明ST562克隆确已发生跨洲际传播,并且早期分离菌株350105有可能是当前ST562流行株的共同祖先。目前ST562菌株跨洲际传播的原因及机制尚未明确。而首个跨洲际流行克隆的出现,改变了以往关于类鼻疽伯克菌传播能力有限及存在地理局限性的认识,相关疫区国家应提高警惕,制订新的类鼻疽防控策略以防止流行进一步扩散。此外,鉴于ST562菌株已在我国海南、台湾地区等多地出现,因此南方各省应加强类鼻疽病原监测,尽早确定其在我国的流行范围及规模。
类鼻疽伯克菌的VNTR位点因其突变率高,变异过大,较少用于溯源研究[11]。然而,本研究的ST562历史菌株、我国海南流行株与澳大利亚流行株之间在MLVA-4四个位点中均出现2个具有相同VNTR重复数的位点,结合PFGE指纹可对ST562克隆的来源及传播、流行过程等做出理论假设:ST562型菌株可能在海南地区存在已久,并已分化为多个MLVA-4型别;近年其中1个MLVA-4型别菌株发生了跨洲际传播并引起大规模流行,但具体的传播机制、流行过程等尚待研究。此外,限制酶切指纹谱比对显示,不同地区(我国海南省与澳大利亚)菌株间的带型差异小于不同年代间菌株的指纹差异。据此推断,如果历史菌株350105是当前ST562流行株的共同祖先,那么后者发生跨洲际传播的时间可能并不遥远,至少是在350105出现的年份(1976年)之后。本研究还将通过全基因组测序等方法对此推断进行验证及深入分析。
利益冲突: 无
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