肝细胞癌（肝癌）具有较高的死亡率^[1-2]。我国是肝癌高发的国家之一，每年死于肝癌的人数占全球肝癌年死亡人数的50%^[3-5]。目前肝癌的发病机制尚不清楚，治疗方式主要通过手术切除，但术后容易转移复发，5年生存率仅有20%~30%^[6]。血管侵袭是影响肝癌转移复发的主要因素之一，在实际治疗过程中，只有术后通过显微镜观察才能判断是否发生血管侵袭，因此，研究其生物标志物对肝癌的预后十分重要。microRNA是一类长度为21~23 nt的内源性小分子RNA，主要通过转录后对靶基因负调控发挥作用^[7]。近年来，国内外学者对microRNA在肝癌的发生、发展中进行了多项研究^[8-14]，但利用公共组学数据研究microRNA在肝癌血管侵袭中的作用鲜有报道。癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和人类肿瘤相关的基因表达汇编（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库是两个最大的组学数据库。本研究分析GEO数据库中177例样本的microRNA芯片表达谱数据，发现在肝癌血管侵袭中高表达的microRNA，并结合TCGA数据库中362例肝癌病例预后数据，发现与预后相关的microRNA，并对其所调控的靶基因进行功能富集（GO）和通路富集（KEGG）分析，解释其可能的分子机制。

对象与方法

1.研究对象：GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中GSE67140数据集^[9]，芯片平台为Affymetrix miRNA Array，包括177例肝癌组织与细胞样本，其中81例血管侵袭阳性组织样本，91例血管侵袭阴性组织样本，2例侵袭能力强的肝癌细胞样本（SNU423、SNU449），3例侵袭能力弱的肝癌细胞样本（HepG2、Hep3B、SNU398）。TCGA数据库（http://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines）中肝癌样本有373例，测序平台为Illumina HiSeq 2000 RNA Sequencing，其中随访资料清晰的样本有362例。

2.研究方法：

（1）差异microRNA分析：运用R语言limma软件进行差异分析。数据经过标准化与log2转换。在差异分析中，对差异倍数的绝对值＞2倍，P＜0.05的microRNA进行下一步研究。

（2）microRNA的靶基因预测：利用microT-CDS平台对microRNA的靶基因进行预测，以P＜0.05为差异临界值^[15]。

（3）靶基因GO和KEGG分析：利用mirPath平台对靶基因进行GO与KEGG分析，以P＜0.05，MicroT＜0.8为差异临界值^[16]。

3.统计学分析：运用R语言及SPSS 22.0软件进行统计分析。应用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，采用对数秩检验（log-rank检验）；Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析。所有统计检验均采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.肝癌侵袭microRNA的表达：分析GEO数据库中GSE67140数据集，其中包括2例侵袭能力强的肝癌细胞样本（SNU423、SNU449），3例侵袭能力弱的肝癌细胞样本（HepG2、Hep3B、SNU398）。如图 1所示，共有110个差异表达的microRNA（认为差异倍数＞2倍，P＜0.05的microRNA有统计学意义），其中在SNU423、SNU449细胞系中表达上调的有50个（包括原始文献报道的microRNA-494），在HepG2、Hep3B、SNU398细胞系中表达上调的有60个。从中挑选hsa-mir-1180、hsa-mir-149、hsa-mir-744、hsa-mir-940，在172例临床组织样本表达谱中验证（81例血管侵袭阳性组织样本，91例血管侵袭阴性组织样本），发现上述4条均在血管侵袭阳性组织样本中表达上调，在血管侵袭阴性样本中表达下调，与细胞水平表达一致（P＜0.05）。见表 1、图 2。

2. 4种差异表达microRNA的生存分析：为分析4种microRNA的预后，选取TCGA数据库中有生存与表达谱数据的362例肝癌病例进行生存分析（表 2、图 3）。其中男性247例（68.2%），女性115例（31.8%）；平均年龄（59.434±13.218）岁；白种人187例（51.7%），非白种人175例（48.3%）；肝癌组织学分级1级54例（14.9%），2级175例（48.3%），3级120例（33.1%），4级13例（3.7%）。其中125例（34.5%）在随访结束时死亡。Kaplan-Meier法单因素生存分析结果显示，hsa-mir-1180、hsa-mir-149、hsa-mir-744和hsa-mir-940高表达组的生存时间均低于其低表达组生存时间（P＜0.05）。为进一步研究microRNA表达对肝癌病例预后的影响，运用Cox比例风险回归模型进行多因素分析，模型中调整年龄、性别、肝癌分级3个变量，结果显示hsa-mir-1180（HR=1.623，95%CI：1.114~2.365，P=0.012），hsa-mir-149（HR=2.400，95%CI：1.639~3.514，P=0.000），hsa-mir-744（HR=1.679，95%CI：1.161~2.427，P=0.006），hsa-mir-940（HR=1.704，95%CI：1.188~2.443，P=0.004）是肝癌病例预后独立危险因素。

3. 4种差异表达microRNA靶基因的GO与KEGG分析：通过对microT-CDS平台预测出来的靶基因进行GO与KEGG分析（图 4、5），靶基因的功能主要与免疫反应、应激、细胞骨架构建相关，主要富集在细胞黏附、连接、细胞间因子-受体反应、免疫反应及Wnt、MAPK、ErbB、PI3K-Akt信号通路上，其中细胞黏附、连接等信号通路是与侵袭功能密切相关的通路。

讨论

microRNA是一类长度为21~23 nt的内源性小分子RNA，具有高度保守性、时序性和组织特异性。microRNA在肝癌的发生发展中起到十分重要的作用。已往研究认为，hsa-mir-199在肝癌组织中特异性低表达，与不良预后及复发相关^[11]。Xu等^[17]发现hsa-mir-101可作用于EZH2，以增强对化疗药物的敏感性，抑制肝癌细胞的增殖、迁移与侵袭。血清中的hsa-mir-16、hsa-mir-21、let-7f、hsa-mir-139可作为肝癌的预后复发的指标^{[10, 12]}。血管侵袭是影响肝癌复发转移的主要原因之一，也是预后危险因素。目前仅有Chuang等^[9]运用芯片技术发现hsa-mir-494通过TET1抑制DNA甲基化，从而抑制多种血管侵袭抑制相关的microRNA表达，进而发生肿瘤血管侵袭。进一步分析发现hsa-mir-1180、hsa-mir-149、hsa-mir-744、hsa-mir-940在侵袭阳性细胞和组织中表达上调（logFC＞1，P＜0.05），生存分析显示4种microRNA为肝癌预后独立危险因素，高表达与患者生存期缩短显著相关（P＜0.05）。

Tan等^[18]发现hsa-mir-1180在肝癌组织中表达下调，可通过NF-κB信号通路的激活抑制肝癌细胞的凋亡促进增殖；动物实验证明抑制hsa-mir-1180表达后，小鼠的移植瘤变小；临床预后分析证实高表达组hsa-mir-1180的生存率低于其低表达组的生存率，与本文结果一致。Lin等^[13]发现hsa-mir-149在肝癌组织中表达下调，过表达可以抑制肝癌细胞的生长，但在裸鼠成瘤动物模型中过表达可以增强肝癌细胞对化疗、放疗的敏感性；Chen等^[19]发现在前列腺癌的侧群细胞中，下调的hsa-mir-149会促进凋亡，抑制其增殖能力，本研究发现hsa-mir-149血管侵袭阳性的组织中表达上调，与文献一致，分析其原因可能因为microRNA具有组织细胞特异性，在不同细胞中表达功能不同。Li等^[20]发现高表达的hsa-mir-774与喉鳞状细胞癌的淋巴结转移相关，抑制其表达后降低细胞侵袭、迁移能力，动物实验表明也减少了肺转移结节的数目；Miyamae等^[21]在94例胰腺癌患者与68例健康对照研究中，发现血浆中hsa-mir-744可以作胰腺癌患者筛查的指标和预后的危险因素，本文结果显示hsa-mir-744在肝癌组织及细胞中表达升高，未在肝癌患者血浆中验证。有研究认为表达的hsa-mir-940可以促进胰腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力^[22]。Liu等^[23]在胃癌研究中发现hsa-mir-940通过抑制ZNF24的功能，促进胃癌细胞迁移和侵袭，本研究发现hsa-mir-940在侵袭能力强的肝癌细胞系中表达上调，提示高表达的hsa-mir-940可能在肝癌中发挥促进侵袭的作用。

目前运用组学手段通过临床样本对血管侵袭标志物的研究较少，大多是细胞水平分子生物学功能的基础研究，本文的创新性在于通过2个数据库的大样本数据（539例），从临床的角度分析了4种microRNA的表达与预后情况，为今后肝癌预后分析提供了新的标志物。

本研究存在不足。如microRNA主要通过对靶基因沉默进行调控，靶基因则通过编码蛋白质发挥功能，由于原始芯片只包含microRNA表达谱的数据，因而研究中未分析靶基因和蛋白的表达情况。今后将通过PCR与免疫组化方法检测靶基因和蛋白表达情况，构建microRNA-mRNA-protein调控网络，进一步解释其分子机制。

综上所述，本研究利用GEO与TCGA数据库初步发现hsa-mir-1180、hsa-mir-149、hsa-mir-744、hsa-mir-940在肝癌血管侵袭中高表达，并影响肝癌预后，可作为肝癌预后的生物标志物。

利益冲突: 无