广西壮族自治区2001－2011年新报告HIV/AIDS人数呈现快速上升趋势，异性性接触传播为主要传播方式，其中，中老年男性所占比例大幅上升^[1]。进一步研究表明，广西壮族自治区中老年嫖客HIV-1的感染率较高^[2-3]，其可能与低档场所暗娼发生不安全商业性行为等因素有关^[4-6]。本研究拟对广西壮族自治区中老年嫖客与暗娼HIV-1感染者的基因亚型特征及传播簇进行研究。

1.研究对象及调查方法：本研究按照地理分布，结合广西壮族自治区艾滋病疫情历年累计报告情况，选择柳州、桂林、贵港、北海4个市的城郊和宾阳县、鹿寨县、都安县、大新县、灵山县、平南县、全州县、灵川县和覃塘区9个县区，共13个调查点开展研究。采用方便抽样的方法，在2012年10－12月，对低档卖淫场所（单次性交易低于50元的场所，或站桩、旅社、出租屋、户外小树林等非固定场所）年龄≥50岁的嫖客及暗娼进行流行病学调查，调查方法见参考文献[6-9]。经研究对象知情同意后，采集5 ml静脉抗凝全血，由当地实验室进行样本处理及HIV抗体初筛，对初筛阳性者血浆标本全部送检广西壮族自治区CDC进行确证试验。确证阳性者作为HIV-1基因亚型测定的对象。

2.核酸提取及基因扩增：取200 μl研究对象血浆样本，采用法国生物梅里埃全自动核酸提取仪NucliSENS^® easyMAG，严格按仪器操作说明提取RNA，置于-80 ℃保存备用。采用RT-PCR和巢式PCR方法扩增HIV-1的pol区基因蛋白酶（全长）和反转录酶区（前300个氨基酸位点），扩增产物大小为1 316 bp，第一轮RT-PCR扩增引物为MAW26（5′-TGG AAA TGT GGA AAG GAA GGA C-3′）和RT21（5′-CTG TAT TTC TGC TAT TAA GTC TTT TGA TGG G-3′），反应条件为50 ℃ 30 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保温。取第一轮PCR产物进行第二轮巢式PCR扩增，扩增引物为Pro-1（5′-CAG AGC CAA CAG CCC CAC CA-3′）和RT-20（5′-CTG CCA GTT CTA GC T CTG CTT C-3′），反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保温。

3.基因产物纯化及测序：PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，经DNA Marker比对确认无误后送至北京梓熙生物科技有限公司进行纯化和测序，测序仪为美国ABI公司PRISM 3730XL，测序试剂为Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing试剂盒。

4.序列分析及亚型鉴定：所获得的原始序列经Sequencher 5.0软件进行序列剪切、次级峰搜索、拼接、清理和混合碱基判读后，加入Los Alamos HIV序列数据库提供的HIV-1分型参考毒株序列和来源于广西壮族自治区及中国其他地区的参考毒株序列，使用BioEdit软件进行序列比对，然后使用Mega 6.0软件中Neighbor-Joining方法（Kimura 2-parameter模型，包括both transitions and transversions，bootstrap＝1 000 replicates）构建pol区序列的系统进化树，根据系统进化树确定基因亚型。将系统进化树上聚集成簇，且校验值＞70的分支定义为可靠进化簇。

1.基本情况：共招募了4 048例中老年嫖客和784例低档场所暗娼，HIV抗体初筛阳性分别为108例和13例。确证试验发现116例HIV-1感染者，其中，中老年嫖客103例，暗娼13例，中老年嫖客和暗娼HIV-1抗体阳性检出率分别为2.5%（103/4 048）和1.7%（13/784）。除了32例HIV-1感染者的血浆标本量不足或前期实验已用完外，其余84例（72.4%，84/116）有足够血浆标本进行HIV-1基因亚型测定，其中，中老年嫖客71例，暗娼13例。核酸提取84例，PCR扩增84例，扩增阳性60例，扩增阳性率71.4%（60/84），基因测序60例，获得序列53例，序列获得率88.3%（53/60），其中，老年嫖客48例，暗娼5例，基本情况见表 1和图 1。

表 1 53例低档场所中老年嫖客与暗娼HIV感染者pol区序列及亚型分布

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图 1 广西壮族自治区低档场所53例中老年嫖客与暗娼HIV-1感染者获得pol区序列的研究对象地理分布

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2. HIV-1毒株基因亚型分析：从美国Los Alamos国家实验室的HIV序列数据库选取114条不同基因亚型参考株序列，包括Feng等^[10]发现目前在中国流行7个CRF01_AE传播簇Cluster 1~7的35条pol区序列（表 2），加上本研究获得的53条pol区序列，共167条pol区序列构建系统进化树，见图 2。图 2结果显示，广西壮族自治区低档场所中老年嫖客与暗娼HIV-1感染者中有3种亚型流行，且都是重组型，其中，CRF01_AE 48例，占90.6%，CRF08_BC 4例，占7.5%，CRF07_BC 1例，占1.9%。

表 2 来自美国Los Alamos国家实验室HIV序列数据库的参考株序列

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图 2 广西壮族自治区低档场所中53例老年嫖客与暗娼HIV-1感染者获得pol区序列的系统进化树

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3.传播簇分析：以Feng等^[10]的研究结果为参照，本研究获得的48条CRF01_AE毒株全部在这7个传播簇的第1和第2簇内，分别占87.5%（42/48）和12.5%（6/48）。CRF01_AE包括4个亚簇C1-SC1、2、3和4，其中，C1-SC1包括大新县某一场所7条序列（中老年嫖客6条序列和暗娼1条序列），此场所人员流动较大；C1-SC2由来源于鹿寨县城内3个不同街区低档场所内的3条中老年嫖客序列聚集在一起，C1-SC3为来源于鹿寨县城郊某一场所2条中老年嫖客序列，C1-SC4为来源于平南县毗邻的镇隆镇和大新镇2条中老年嫖客序列。4例CRF08_BC也聚集成一簇，其中，3条中老年嫖客序列来源于灵山县那隆镇和三隆镇，另1条中老年嫖客序列来源于宾阳县武陵镇。

本研究为2012年广西壮族自治区对低档场所的中老年嫖客与暗娼进行较大样本的分子流行病学研究。中老年嫖客HIV-1抗体阳性检出率为2.5%，低于2008年云南省横断面调查嫖客人群的阳性检出率（6.0%）^[11]。暗娼HIV-1抗体阳性检出率为1.7%，略低于2011年广西壮族自治区低档场所暗娼HIV-1抗体阳性检出率（2.1%）^[12]。

广西壮族自治区低档场所中老年嫖客与暗娼HIV-1感染者流行毒株以CRF01_AE为优势毒株。1996－1997年，广西壮族自治区在静脉注射吸毒人群中HIV-1感染者发现CRF01_AE和新的BC重组型（后来证实为CRF08_ BC）流行^[13]。2006年全国艾滋病分子流行病学调查显示^[14]，广西壮族自治区新发现报告病例中以CRF01_AE（53.4%）为主，其次是CRF08_BC（35.7%）和CRF07_ BC（6.4%）。刘伟等^[15]分析广西壮族自治区13个市2008－2009年报告的272例患者以CRF01_AE为主，占77.6%。而本研究发现CRF01_ AE、CRF08_BC和CRF07_BC 3种流行重组型，以CRF01_AE为主，占90.6%，均高于广西壮族自治区历年报告。

CRF01_AE传播簇1又形成4个亚簇。进一步分析发现有2个亚簇毒株来源于同一低档场所，1个亚簇毒株来源同一县城郊附近3个低档场所，1个亚簇毒株来源于同一省道相距约10 km的相邻乡镇。另外，4例聚集成簇的CRF08_BC毒株序列对象也来源于同一省道相邻乡镇，其中3条序列对象来源的乡镇相距约10 km。提示广西壮族自治区低档场所暗娼与中老年嫖客HIV-1感染者的流行毒株呈现小范围聚集性，外源性毒株输入的可能性小，当地HIV-1阳性的中老年嫖客或暗娼可能是该人群毒株快速传播的重要传染源。

根据本研究发现低档场所中老年嫖客与暗娼HIV-1感染者流行毒株的新特点，应及时调整艾滋病防治对策，不断加强中老年人群的警示性教育，并为其免费提供方便可及的安全套发放措施；同时严厉打击卖淫嫖娼的违法行为，为嫖客与暗娼感染者提供及时治疗服务，从而更好地预防HIV新发感染及有效控制广西壮族自治区中老年男性艾滋病疫情。