由于耐药结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的产生及其引起的耐多药结核病（multiple drug resistant tuberculosis，MDR-TB）和广泛耐药结核病（extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）的流行，一线抗结核药物已不能满足临床的治疗需求，结核病的预防控制变得更为困难。目前对结核分枝杆菌二线抗结核药物的耐药性研究甚少，阐述重要二线抗结核药物的耐药分子机制显得较为迫切。环丝氨酸在50年前就开始应用于临床，但因过敏和神经毒性而受到限制。近年，伊朗、印度等国家采用含有环丝氨酸治疗MDR-TB取得了较好疗效^[1-2]，但环丝氨酸耐药机制尚不清楚。在结核分枝杆菌中，丙氨酸消旋酶（alr）将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，丙氨酸合成酶（ddl）主要催化2分子D-丙氨酸合成d-丙氨酰-D-丙氨酸二肽；环丝氨酸为D-丙氨酸的结构类似物，通过抑制结核分枝杆菌的alr和ddl两种酶，进而抑制细菌细胞壁粘肽的形成，导致结核分枝杆菌细胞壁缺损，减少其耐酸能力而起到杀菌及抑菌的效果^[3-4]。已有报道，结核分枝杆菌alrA基因的非同义突变与环丝氨酸获得性耐药相关^[5-6]。cycA属于氨基酸转运家族，负责D-丙氨酸、D-丝氨酸的运输，涉及环丝氨酸的正常吸收^[7]。cycA基因单一点突变已经在大肠埃希菌环丝氨酸耐药变异株中得到确认^[8]。cycA编码的运载通透蛋白，其正常表达影响环丝氨酸的转运吸收。Baisa等^[9]发现，在微量葡萄糖和甘油培养基中大肠埃希菌cycA基因突变株K-12和CFT073的环丝氨酸耐药性增加，表现为最小抑菌浓度（MIC）值升高。早期也有报道大肠埃希菌的环丝氨酸耐药性增加也是cycA点突变导致^[10-11]。Halouska等^[12]的研究认为，环丝氨酸是通过抑制包括ddlA基因在内的多种与结核分枝杆菌细胞壁合成相关的蛋白酶从而抑制结核分枝杆菌。此外，在牛型卡介苗cycA中发现的一个非同义突变Gly122Ser能够部分解释环丝氨酸的固有耐药现象^[7]。本研究通过对145株临床结核分枝杆菌菌株的alrA、ddlA和cycA基因全长测序，初步探讨环丝氨酸耐药分子机制和潜在靶点，并对环丝氨酸耐药与我国结核分枝杆菌北京基因型之间的相关性进行分析。

1. 菌株来源：145株结核分枝杆菌临床分离株从中国CDC传染病预防控制所（传染病所）菌株库中选取，来源于福建、广西、河南、湖南、四川、新疆和西藏等省份的省级结核病防治所或结核病医院，由传染病所结核室进行菌种鉴定，并进行药敏试验。标准菌株H37Rv由传染病所提供。

2. 比例法：按照《结核病诊断实验室检验规程》进行，每批实验均以标准株H37Rv做平行对照。环丝氨酸培养基药物折点浓度为WHO推荐的30 μg/ml^[13]。

3. 微孔板显色法：具体步骤参照Hall等^[14]报道。采用倍比稀释法配置环丝氨酸药物浓度为128～0.063 μg/ml。设置不含药液的微孔板为空白对照，培养第4天加入70 μl的显色剂（刃天青：5%吐温80为2 ∶ 5）观察，当蓝色变粉红色说明细菌已生长，此时将显色剂加入实验孔中，MIC为蓝色完全没有发生变化的实验孔的药物浓度。

4. PCR扩增测序：采用Primier 5.0设计引物，目的基因分上下两段进行扩增，各段基因引物序列见表 1。反应采用25 μl的体系，包括12.5 μl的2×PCR Taq MasterMix（北京康为世纪生物科技有限公司），9 μl的双蒸水，上下游引物各1 μl，DNA模板1.5 μl。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，退火1 min（退火温度见表 1），72 ℃ 1 min，35次循环；72 ℃ 10 min。PCR产物送北京天一辉远生物科技公司测序。

表 1 结核分枝杆菌alrA、ddlA和cycA基因PCR扩增相关信息

表选项

5. 间隔区寡核苷酸分型（spoligotyping）：采用Kamerbeek等^[15]建立的标准化程序进行。引物DRa：5′-GGT TTT GGG TCT GAC GAC-3′，DRb：5′-CCG AGA GGG GAC GGA AAC-3′。反应条件：96 ℃ 3 min；96 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

6. 数据分析：基因测序结果采用SeqMan 7.1.0进行序列拼接、BioEdit 7.1.10进行多序列比对。记录spoligotyping的43个间隔区杂交结果，间隔区存在用“1”表示，缺失用“0”表示，建立Excel数据表，并将其导入BioNumerics 5.0软件进行分析。聚类方式用平均连锁聚类法（UPGMA），相似系数选用Dice，与数据库SpolDB 4.0进行比对，确定各个菌株基因型。spoligotyping基因型对环丝氨酸耐药率差异采用 χ²检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1. 药敏结果：比例法药敏试验结果显示，145株所选临床分离株中24株对环丝氨酸耐药。微孔板刃天青法显示24株耐药菌株中，5株MIC为16 μg/ml，12株MIC为32 μg/ml，6株MIC为64 μg/ml，1株MIC为128 μg/ml。

2. DNA测序分析：以标准株H37Rv序列为对照，用BioEdit 7.1.10进行多序列比对，通过测序峰图确认突变位点，结果显示，alrA、ddlA和cycA基因突变类型均为点突变。环丝氨酸耐药菌株中alrA突变率为4.2%（1/24），突变株261位AGC→AAC（Ser→Asn），1株敏感株alrA基因337位GGT→GGC，为Gly同义突变。耐药菌株中未发现ddlA突变，仅1株敏感株92位CGT→CGC，为Arg同义突变。环丝氨酸耐药菌株中cycA突变率为12.5%（3/24），分别为188位CCT→GCT（Pro→Ala）、318位CGA→CTA（Arg→Leu）和508位GCA→TCA（Ala→ Ser），无突变热点区域。环丝氨酸敏感株中cycA 存在2种同义突变，分别为521位CGT→CGC（Arg）和406位TCG→TCA（Ser），其中406位突变有2株菌株。见表 2。

表 2 145株结核分枝杆菌临床分离株中alrA、ddlA和cycA基因突变情况

表选项

3. spoligotyping基因分析：对145株临床分离株spoligotyping的杂交结果指纹图谱进行分析，与数据库SpolDB 4.0进行比对。结果显示，北京基因型共88株，占60.7%（88/145），包括86株经典型北京基因型（图谱显示为35～43之间的9个间隔区均为阳性）；2株为非典型北京基因型（图谱显示为35～43之间的9个间隔区至少3个为阳性且至少1个为阴性）。非北京基因型共57株，占39.3%（57/145）。非北京基因型中，大部分为T家族，占35.1%（20/57），3株为CAS1家族，占5.3%（3/57），6株为H3家族，占10.5%（6/57），6株为MANU2家族，占10.5%（6/57），1株为S家族，占1.8%（1/57），4株为U家族，占7.0%（4/57）。17株为新发现菌株基因型，占29.8%（17/57）。

4. 不同基因型的耐药率比较：88株北京基因型结核分枝杆菌中，环丝氨酸耐药18株，耐药率为20.5%（18/88），57株非北京基因型中环丝氨酸耐药6株，耐药率为10.5%（6/57），耐药率差异无统计学意义（ χ²＝2.47，P＞0.05）。见表 3。

表 3 145株结核分枝杆菌不同基因型耐药率

表选项

本研究对所选菌株的alrA、ddlA和cycA基因测序发现，有1株（4.17%）耐药株alrA基因发生非同义突变，3株（12.5%）耐药株cycA基因发生非同义突变，而敏感株中未见目的基因的非同义突变。 经药敏试验证实，4株非同义突变株MIC值均有不同程度的升高。本研究结果提示，alrA和cycA基因发生的单核苷酸非同义突变导致了菌株环丝氨酸耐药性增加。Desjardins等^[16]的研究显示，alrA和ald突变的结核分枝杆菌临床菌株在体外培养时，有对环丝氨酸耐药性增加的现象。Fehér等^[8]对大肠埃希菌环丝氨酸耐药株的研究显示，20株cycA突变涉及位点均不相同。本研究结果也反映出cycA突变位点比较分散，未发现基因突变的热点区域，这将不利于单核苷酸突变的分子检测技术建立。从突变情况来看，尚有较大比例的环丝氨酸耐药现象不能被很好地解释，推测环丝氨酸还存在其他耐药靶酶或其他耐药机制，尚待进一步研究。环丝氨酸中枢神经系统的不良反应能够被大多数患者所耐受，环丝氨酸被一些研究者视为治疗MDR-TB的基础成分，取得的临床效果不能被忽视。研究环丝氨酸的耐药分子特征有助于实现对耐多药结核病患者更好的治疗，未来还可以环丝氨酸为药物原型，开发新型抗结核药物，协助攻克治疗结核病的难题。

北京基因型菌株与耐药的关系复杂多变，国内外不同国家和地区存在差异，不同药物之间也不一致。在纽约、古巴、爱沙尼亚和越南，北京基因型与耐药高度相关，但是在其他地区暂未发现明显关联性^[17]。先前的研究发现，在越南和俄罗斯，北京基因型菌株与喹诺酮高水平耐药相关^[18-19]。本研究未发现北京基因型菌株与环丝氨酸耐药存在较大关联。