子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全世界每年有近50万新发病例，死亡27.4万例^[1]，其发病率占女性肿瘤的5%^[2]，且85%以上的子宫颈癌发生在发展中国家^[3]。流行病学与分子生物学研究表明，人乳头瘤病毒（HPV）特别是HPV16感染是子宫颈癌的主要病因^[4]。育龄女性HPV感染现象普遍存在，但只有小部分发展成子宫颈癌^[5]，提示HPV感染并不是子宫颈癌发生的唯一影响因素。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）三级酶促级联反应中重要的一个家族。ERK家族的5个亚家族中，ERK1/2作为Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的重要成分，是将信号从细胞表面受体转导至细胞核的关键成员。ERK1/2被激活后，以磷酸化（p-ERK1/2）的形式介导信号由细胞质向细胞核传递，参与调节细胞的生长、发育、分化、分裂、死亡等多种生理过程，并在细胞的恶性转化中起重要作用^[6]。已有研究表明，ERK1/2的活性与HPV16密切相关^[7-8]。在HPV16感染时，尖锐湿疣角质形成细胞中可能使ERK激活增加^[9]。Crusius等^[10]也发现HPV16 E5基因产物能通过EGF依赖途径激活ERK和促细胞增殖。然而，ERK1/2表达在子宫颈癌变过程中的作用及其与HPV16感染的关系相关研究较少。本研究从人群研究和体外研究的角度，探讨ERK1/2在子宫颈癌变中的表达及其与HPV16感染的交互作用，以期为子宫颈癌的研究提供一定的理论依据。

1.研究对象：选取2013年9月至2014年3月在山西省肿瘤医院、山西省妇幼保健院、山西省晋煤集团总医院经组织病理学确诊的各种子宫颈病变女性176例为研究对象，包括正常子宫颈（normal cervical，NC）女性34例、低度子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasm Ⅰ，CINⅠ）患者26例、高度子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasmⅡ/Ⅲ，CINⅡ/Ⅲ）患者57例、子宫颈鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）患者59例。其中，CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ和SCC组均为新发病例，且术前未接受放疗或化疗，并排除其他严重疾病患者和其他肿瘤患者。NC组为医院进行子宫颈癌筛查、TCT检测和阴道镜下病检均无异常的女性，以及住院患者中行子宫肌瘤切除术后子宫颈病检正常的女性。

2.资料收集：本研究通过山西医科大学医学伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。采用结构式问卷收集研究对象的人口学特征、生活习惯、月经婚育史、妇科病史、肿瘤家族史等资料。同时收集全部研究对象经手术或活检的子宫颈石蜡组织标本。

3.子宫颈癌细胞株的选择与ERK抑制：选择HPV16阳性Siha子宫颈癌细胞和HPV阴性C33A子宫颈癌细胞进行研究。以施加和不施加ERK抑制剂U0126作为干预组和对照组。经过对U0126不同时间、不同浓度的抑制效果预实验，最终确定24 h、4 μmol/L和24 h、1 μmol/L分别为Siha细胞和C33A细胞的最适时间和最适浓度。

4.实验方法：

（1）PCR法检测HPV16感染：采用酚-氯仿蛋白酶K法提取子宫颈组织DNA，用PCR仪进行HPV16 DNA的扩增，将HPV16 DNA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以确定HPV16感染状态，具体步骤见文献[11]。

（2）免疫组化法检测子宫颈组织中p-ERK1/2蛋白的表达：取石蜡包埋组织，连续切片至4 μm，置于载玻片上。严格按照免疫组化试剂盒（PV-900，北京中杉金桥生物技术有限公司）操作步骤进行检测，p-ERK1/2抗体购自英国Abcam公司，1 : 100稀释。染色后由2名观察者进行盲法阅片：染色程度不着色、淡棕色、棕色、深棕色分别计为0、1、2、3分；阳性范围0%、1%~25%、26%~50%、＞50%分别计为0、1、2、3分。最终将两者相加为总分：0~1分为（-），2分为（+），3~4分为（++），5~6分为（+++）。阳性表达率为结果“+~+++”的例数占总例数的比例。

（3）细胞计数法测定细胞生长：取对数生长期的细胞（1×10⁵个/ml）培养24 h后，向干预组加U0126，对照组添加培养液，24 h后收集细胞制成细胞悬液，台盼蓝染色，计数。活细胞不着色，死细胞着蓝色，每孔重复计数3次。细胞抑制率=（对照组细胞总数-干预组细胞总数）/对照组细胞总数×100%

（4）流式细胞仪检测细胞周期与凋亡：取对数生长期细胞（1×10⁵/ml），用0.25%的胰蛋白酶进行消化，制成细胞悬液，离心，弃上清。PBS洗涤，过滤，离心，弃上清。PE染色（Annexin V-PE凋亡试剂），用流式细胞仪检测、分析细胞的增殖和凋亡。

5.统计学分析：利用SPSS 20.0软件，采用χ²检验、趋势χ²检验比较组间率的差异；采用OR值及其95%CI评价疾病与因素间的关联强度；应用相加模型进行交互作用定性和定量评估。以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.子宫颈癌变的相关因素分析：NC组、CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和SCC组的年龄分别为29~55（42.97±6.91）岁、29~56（44.35±7.69）岁、28~64（44.05±8.33）岁和28~70（50.25±8.32）岁。各组间在年龄、文化程度、职业、洗澡频率、洗阴频率、首次性交年龄、月经初潮年龄、妇科病史、产次等方面的差异有统计学意义（均P＜0.05），在肿瘤家族史、吸烟、饮酒、人工流产史、经期性生活、性生活后清洗、首次生育年龄、绝经、孕次等方面的差异无统计学意义（均P＞0.05），见表 1。

表 1 研究对象的人口学特征及相关因素

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2. HPV16感染与子宫颈癌变的关系：HPV16感染率在CINⅠ组（42.3%）、CINⅡ/Ⅲ组（56.1%）及SCC组（62.7%）均高于NC组（17.6%）。随着子宫颈病变程度的加重，HPV16感染导致的子宫颈癌变风险呈逐渐升高趋势（趋势χ²=17.99，P＜0.001），尤其是在调整子宫颈癌变相关因素后，在CINⅡ/Ⅲ组和SCC组的致病危险性有统计学意义，见表 2。

表 2 HPV16感染与子宫颈病变的关系

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3. p-ERK1/2蛋白表达与子宫颈癌变的关系：p-ERK蛋白阳性表达主要位于细胞核，部分出现于细胞质，呈点、片状分布，在各子宫颈病变组中均有不同程度的表达（图 1）。p-ERK1/2蛋白的阳性表达率在NC组、CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和SCC组分别为39.4%、54.2%、58.9%和74.1%，总体分布差异有统计学意义。随着子宫颈病变的加重，p-ERK1/2蛋白引起的子宫颈癌变危险性呈逐渐升高趋势（趋势χ²=10.58，P=0.001），特别是在CINⅡ/Ⅲ组和SCC组，这种效应在调整子宫颈病变相关因素后依然存在，见表 3。

注：细胞核呈棕黄色染色为p-ERK表达阳性；A、B：子宫颈癌组；C、D：CINⅡ/Ⅲ组；E、F：CINⅠ组；G、H：NC组 图 1 p-ERK1/2蛋白在不同程度子宫颈病变组织中的表达（A、C、E、G：免疫组化×100；B、D、F、H：免疫组化×400）

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表 3 不同子宫颈病变组中p-ERK1/2蛋白的表达

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4. p-ERK1/2蛋白表达与HPV16感染之间的相互作用：以NC组为对照，应用相加效应模型对子宫颈病变中HPV16感染和p-ERK1/2蛋白表达进行交互作用分析，结果显示，HPV16感染和p-ERK1/2蛋白阳性表达在CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和SCC组均存在正相加交互作用，交互作用指标AP值显示正相加效应，见表 4。

表 4 HPV16感染和p-ERK1/2蛋白表达的交互作用分析

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5. ERK对子宫颈癌细胞增殖、凋亡的影响：采用U0126干预Siha和C33A两种细胞后，在不同时间点，干预组活细胞数少于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.001）。随着干预时间的延长两细胞的抑制率逐渐增加，72 h达到高峰并持续至120 h无明显变化，且2种细胞在各时点的抑制率差异无统计学意义（图 2A）。采用流式细胞仪检测细胞凋亡和周期变化的结果显示，干预组2种细胞的凋亡率均明显增加（P＜0.01），而细胞增殖指数[PI={（S+G₂/M）÷（G₀/G₁+S+G₂/M）}×100%]降低（图 2B）。干预后，Siha细胞的增殖指数较C33A细胞高，而凋亡率则低（图 2C）。

注：A：U0126干预对Siha和C33A细胞的抑制作用；B：U0126干预对Siha和C33A细胞增殖的影响；C：U0126干预对Siha和C33A细胞凋亡的影响；aP＜0.01，bP＞0.05 图 2 U0126干预对子宫颈癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响

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ERK发现于20世纪80年代末，属于丝氨酸/苏氨酸激酶类信号蛋白，可将细胞外各种刺激信号传递到细胞内，并引发一系列生物反应，其持续活化最终促进细胞的增殖和恶性转化。ERK可被多种癌基因产物激活发生磷酸化，形成的p-ERK是ERK信号通路被激活的标志。有研究表明，ERK的异常活化与子宫颈内瘤变有关。Chen等^[12]研究显示，从CN组、子宫颈癌前病变组到子宫颈癌组，p-ERK1/2的表达水平逐渐增高。章丽霞等^[13]的研究也表明，随着子宫颈病变的加重，ERK2和p-ERK1/2在各子宫颈病变组中的表达率逐渐升高，同时发现ERK2和p-ERK1/2在子宫颈癌不同临床分期、病理分级以及淋巴转移者中的表达有差异，提示ERK2和p-ERK1/2与子宫颈癌变的发生、发展和预后密切相关。

本研究结果显示，随着子宫颈病变的加重，p-ERK1/2蛋白的表达量呈逐渐升高的趋势，特别是在CIN组p-ERK1/2的蛋白表达水平明显高于NC组，提示p-ERK1/2高表达可增加子宫颈癌及癌前病变的危险，p-ERK1/2的异常表达可作为子宫颈癌变发生的早期预警标志。同时，本研究结果表明，对子宫颈癌细胞进行ERK抑制后，抑制了细胞的增殖、促进了细胞的凋亡、提高了细胞在G₀/G₁期的比例、降低了G₂/M期比例，不仅验证了子宫颈癌的发生与ERK的活化密切关联的理论，而且揭示ERK对子宫颈癌细胞具有促进增殖、抑制凋亡和致细胞周期紊乱的作用、进而促进了子宫颈癌的发生。

大量证据表明，高危型HPV持续感染是子宫颈癌及其癌前病变最主要的病因，而HPV16在子宫颈癌患者中检出率达50%以上，是至今在全球范围内最常见的致癌型别^[14]，HPV16 E6、E7癌蛋白是HPV DNA与宿主DNA整合后发生致癌作用的主要元凶。有研究用E6转染不同子宫颈癌细胞株发现，转染后的子宫颈癌细胞株中MAPK信号通路活性增强，提示E6癌蛋白与ERK信号通路密切相关^[7]。Yuan等^[8]发现，E7癌蛋白可通过MEK-ERK和AP-1信号转导通路来调节钙粘蛋白的表达，而在调节钙粘蛋白介导的细胞连接的过程中，该信号通路的活性也增强。

本研究发现，随着子宫颈病变程度的加重，HPV16的感染率逐渐升高，且HPV16感染和p-ERK1/2蛋白表达在子宫颈癌变中存在正相加交互效应。交互作用定量分析的结果进一步揭示，与正常子宫颈组相比，HPV16感染和p-ERK1/2蛋白高表达的交互作用导致CINⅠ、CINⅡ/ Ⅲ和SCC的危险性是其他因子所致危险性的2.40、8.36和35.82倍，分别占CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ和SCC发病风险的36%、52%和69%；同时由交互作用分析S值可知，两因素同时存在所致CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ和SCC发生的危险性是其各自单独存在所致危险性之和的1.73、2.26和3.36倍。提示随着子宫颈病变的加重，这种交互作用可能有逐渐增强的趋势。同时，在本研究中发现，抑制ERK后，HPV16阳性的Siha细胞增殖指数高于HPV阴性的C33A细胞，而凋亡率则低于C33A细胞。结合本组前期研究^[15]，ERK抑制后，HPV阳性的Hela细胞的p-ERK1/2蛋白表达水平高于HPV阴性的C33A细胞，提示HPV感染可能有增加ERK1/2蛋白活化的作用。这一发现对于临床制定个体化治疗方案具有指导意义，为深入研究HPV感染激活生物信号通路，寻找有效生物治疗靶点开拓了新思路。

本研究选择了不同子宫颈病变阶段的女性为研究对象，从群体角度揭示了从NC、CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ到SCC发展过程中ERK表达和HPV16感染的变化特点和相互作用规律，但未从前瞻性观察的角度揭示这一过程。此外，本研究对象均来自医院，可能存在一定的选择偏倚。为了进一步验证ERK表达和HPV16感染对宫颈癌变发生与进展的作用，尚需进行前瞻性队列研究，以提供更为可靠的证据。