引用本文
穆玉姣, 张白帆, 赵嘉咏, 王泽乾, 夏胜利, 黄学勇, 许汴利 . 河南省外环境中沙门菌流行特征和分子分型研究[J]. 中华流行病学杂志, 2016, 37(10): 1404-1408
Mu Yujiao, Zhang Baifan, Zhao Jiayong, Wang Zeqian, Xia Shengli, Huang Xueyong, Xu Bianli . Distribution and molecular type of
Salmonella from external environment in Henan province[J].
CHINESE JOURNAL OF EPIDEMIOLOGY, 2016, 37(10): 1404-1408.
1. 450016 郑州, 河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所;
2. 456750 淇县疾病预防控制中心
收稿日期: 2016-05-20
项目资助: 国家科技重大专项（2012ZX10004201，2013ZX10004203）
1. Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Zhengzhou 450016, China;
2. Qixian County Center for Disease Control and Prevention, Qixian 456750, China
沙门菌广泛存在于自然界，能引起多种动物感染。沙门菌是在温、冷血动物肠道保菌，再通过动物粪便污染饲料、食品（蛋、家禽、肉类产品）、水产品和污水等外环境的生态循环。受污染的动物肉类和蛋类食品是人类沙门菌病的主要感染源[1]。为掌握河南省外环境中沙门菌的流行情况，遂对2011－2013年从部分地区采集的4 488份动物粪便、生熟食品和厨具等标本分离的324株沙门菌进行血清型研究，以了解其流行特征；并用PFGE对流行菌株分子分型以揭示菌株间的同源性，为控制沙门菌环境污染和防控食源性疾病提供技术依据。
材料与方法
1. 菌株来源：2011－2013年在河南省商丘市、周口市、济源市、睢县、登封市和中牟县动物养殖场、菜市场、饭馆采集动物粪便、生熟食品和厨具等各类标本4 488份。经过SBG增菌、沙门菌科玛嘉培养、系统生化鉴定和血清学鉴定，分离出沙门菌324株。
2. 主要试剂和仪器：沙门菌科玛嘉鉴定培养基（法国CHROMAgar公司）、脑心浸液、API20E肠杆菌科细菌鉴定板条（法国bioMérieux公司）、沙门菌诊断血清（丹麦SSI公司）、Seakem Glod琼脂糖（美国LONZA公司）、蛋白酶K（英国Roche公司）、限制性内切酶XbaⅠ[宝生物工程（大连）有限公司]、Tris-HCl/EDTA/5×TBE（北京索莱宝公司）。VITEK浊度仪（法国bioMérieux公司）、去离子水系统（美国Milipore公司）、SHZ-C型水浴摇床（上海博迅仪器公司）、三温水浴锅（北京东方精瑞公司）、Minispin台式离心机（德国Eppendorf公司）、PFGE系统及凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）
3. 实验方法：
（1）菌株的生化鉴定与血清分型：从沙门菌科玛嘉平板上直接挑取淡紫色菌落转种脑心浸液平板，37 ℃培养16～18 h，0.85%生理盐水制备0.5麦氏浊度菌液，API20E肠杆菌科系统生化鉴定，沙门菌诊断血清进行O相玻片凝集分型，再利用0.4%营养软琼脂（参见WHO沙门菌鉴定手册）进行H相（1/2相）鞭毛诱导与血清凝集，生理盐水做自凝对照。根据K-W血清分型表确定对应血清型别。
（2）PFGE分型：按照国际Pulsenet网络实验室与美国CDC公布的沙门菌标准分型方法，对324株沙门菌菌株进行PFGE分子分型，沙门菌标准株H9812作为分子质量标记。限制性内切酶XbaⅠ（50 U），37 ℃酶切2 h。电泳参数：电压6 V/cm，脉冲时间2.2～63.8 s，线性转换，电场角度120°，电泳时间19 h，电泳液温度14 ℃。电泳结束后胶块用GelRed染料染色20 min后纯水清洗30 min后凝胶成像仪拍照（曝光时间3.0 s，去过饱和成像）。
4. 数据分析： 用BioNumerics 6.0软件对电泳图谱进行数据分析，绘制聚类分析树状图。聚类算法为非加权配对平均法（UPGMA），电泳条带位置优化度（position tolerance）1.5%，相似度100%认定为同一PFGE带型。
结 果
1. 菌株来源： 沙门菌分离率为7.21%（324/4 488）；分别分离自18种食品及动物粪便。其中从生鸡肉中分离的沙门菌最多为78株，分离率为16.49%（78/473）；其次为生猪肉（64株），分离率为13.88%（64/461）；鸡粪分离出56株，分离率为10.93%（56/512），猪粪分离出46株，分离率为9.58%（46/480）。见表 1。
2. 菌株血清分型：应用玻片凝集法对324株沙门菌进行血清分型，共分为7个群、39种血清型，其中以B群检出最多（50.61%），有11种血清型164株菌，其次是C群（12.03%）（表 2）。每年血清型的分布及种类也不相同，2010年和2011年有20种血清型，2012年有21种，且每年均检出稀有血清型。肠炎沙门菌是最常见的血清型，占24.07%（78/324），其次是德尔卑沙门菌（20.37%，66/324）、鼠伤寒沙门菌（10.80%，35/324）、印第安纳沙门菌（7.09%，23/324）、4，5，12：i：-和阿贡纳沙门菌（4.62%，15/324），这些血清型占沙门菌分离株的（71.6%，232/324），见表 3。
3. PFGE分析： 对排名前两位的部分肠炎沙门菌和德尔比沙门菌进行PFGE分型。46株肠炎沙门菌经XbaⅠ酶切后共分为12种带型，分别命名为EN1～12，各带型包含菌株数为1～12株不等，带型相似度为80%～100%。其中EN1有5株菌，EN4有12株菌，EN6和EN7各有6株菌，EN9有9株菌，为该血清型的优势带型，其余7种带型各有1～2株菌。对46株肠炎沙门菌的宿主分析发现，绝大多数来自于鸡宿主源（鸡酮体、鸡内脏、鸡粪等）（图 1）。30株德尔比沙门菌XbaⅠ酶切后共分为17种带型，分别命名为DER1～17，各带型包含菌株数为1～8株不等，带型相似度为46.7%～100.0%。其中DER3有6株菌，DER7有8株菌，为该血清型的优势带型，其余15种带型各有1株菌。对30株德尔比沙门菌的宿主分析发现，大多数来自于猪宿主源（猪肉和猪粪）（图 2）。
讨 论
对2011－2013年河南省外环境分离的324株沙门菌的宿主、血清型及其分子分型分析发现，生熟肉制品、水产品、动物粪便及厨房用具中均有检出，以生鸡肉和生猪肉中菌株的分离率较高，其次是鸡粪和猪粪。分离菌株血清型分布广泛，且不同宿主血清型的分布特征也有很大差异。324株沙门菌经血清学鉴定分属于7个群39种血清型，表明河南省外环境中沙门菌血清型分布具有多样性。以B群沙门菌检出最高，其次是D群沙门菌。血清型位于第一位的是肠炎沙门菌，其次是德尔卑沙门菌和鼠伤寒沙门菌，与临床流行病学调查基本相符[2]。但与省内腹泻病例及生肉食品中分离的前五位沙门菌血清型略有不符[3-4]，说明不同来源的沙门菌的血清型有一定差异。通过对宿主分析发现，肠炎沙门菌绝大多数来自于鸡宿主源（鸡酮体、鸡内脏、鸡粪等），而德尔比沙门菌大多数来自于猪宿主源（猪肉和猪粪），结合国内相关研究数据[5-9]，表明肠炎沙门菌是污染家禽产品的优势血清型，而德尔比沙门菌是生猪养殖及屠宰环节中的优势血清型。提示河南省肉类食品沙门菌污染与养殖场的卫生条件有很大关联。
PFGE聚类分析显示，46株肠炎沙门菌分为12个带型，优势带型为EN4和EN9，其次是EN6、EN7和EN1；30株德尔比沙门菌分为17种带型，优势带型为DER7和DER3。分析这些优势带型的宿主和分离地，发现同一带型大多源自同一个地区和同一宿主源。提示相同的污染源可能持续存在，并且来源于同一养殖场或同一家屠宰场。在食品生产加工和流通环节中，污染来源很可能相近或相同，极易引起食源性疾病，所以人感染的沙门菌和外环境中存在的沙门菌是否具有同源性还有待进一步分析，但相关监管部门应从控制传染源的角度进一步加强对畜禽类行业的监督检查，以减少沙门菌的感染。
2016, Vol. 37
表1(Table 1)
