530028 南宁, 广西壮族自治区疾病预防控制中心 急性传染病防制所
Study of epidemiological characteristics and viral sources of dengue fever outbreak in Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2014
Institute of Emerging Infectious Diseases Prevention and Control, Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and Prevention, Nanning 530028, China
登革热是传播速度较快的蚊媒病毒病之一,近30年在全球超过100个国家引起暴发流行,全球约25亿~40亿人存在感染DENV的风险,每年约有3.9亿人感染DENV[1-4],已经成为全球面临的重大公共卫生问题[5-6]。由于经济全球化发展、国际间旅行和城市扩张等因素影响,我国由输入病例引起的登革热暴发流行风险不断升高[7-8],广东[9-11]、云南[12]、福建[13]、河南[14]等省均报告了由输入病例引起的登革热暴发。广西壮族自治区(广西)白纹伊蚊分布广泛且密度高,发生登革热流行风险极高[15],曾于1980年和1986年两次报告登革热疫情暴发[16]:1980年广西合浦、钦州市暴发第一次登革热疫情,共报告1 515例病例,死亡2例;第二次登革热疫情于1986年在北海市暴发,106名当地居民被感染。之后28年,广西没有本地登革热疫情报告。2014年广西暴发第三次本地登革热疫情,共报告登革热病例854例。为明确此次疫情特征和病原来源,本文对此次登革热疫情的流行病学和病原特征进行分析。
对象和方法
1. 病例定义:依据原卫生部颁发的《登革热诊断标准》(WS 216-2008),分为疑似、临床诊断和实验室诊断病例。根据获得感染地域不同分为输入病例和本地病例,本地病例指发病前14 d内未离开本县区(现住址)的登革热病例;输入病例包括境外输入病例和境内输入病例两类。境外输入病例指发病前14 d内到过登革热流行的国家或地区的病例。境内输入病例是指发病前14 d内离开本县区(现住址)、到过本县区外的境内登革热流行地区的病例。
2. 研究方法:
(1)流行病学资料收集和分析:报告的登革热病例信息来自中国CDC信息系统和现场流行病学个案调查。病例流行病学个案调查由当地CDC工作人员与患者面对面访谈完成,主要变量包括患者性别、年龄、职业等。数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。
(2)标本收集和DENV NS1抗原检测:医疗机构医务人员对诊断为登革热疑似病例采集非抗凝血液标本2~5 ml,24 h内送辖区市级CDC进行DENV NS1抗原(北京万泰生物药业股份有限公司)检测。分离的血清保存于2 ml螺口冻存管中,置-70 ℃冰箱保存。DENV NS1抗原检测阳性标本送广西CDC进行病毒分离和DENV血清分型。
(3)核酸检测:采用磁珠法提取病例血清中病毒RNA(Ambion by life technologies),血清分型和E基因扩增采用一步法RT-PCR试剂盒进行检测(Qiagen),DENV通用引物和血清分型引物序列参考《登革热诊断标准》(WS 216-2008),E基因扩增引物参考文献[17]。实验操作步骤参考试剂盒说明书。
(4)序列测定:测序均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。用于序列进化分析的参考株来自GenBank,使用ClustalX 1.8 软件和Mega 6.0 软件进行核苷酸序列比对和一致性分析,并用邻接法(NJ)构建核苷酸系统进化树,可信度评估采用Bootstrap,取1 000次重复。
结果
1. 流行病学特征:广西于2014年6月13日报告首例输入性登革热病例,9月23日报告首例本地病例;2014年6月13日至2014年12月8日共报告登革热病例854例,其中临床诊断病例142例,实验室诊断病例712例,无死亡病例。854例病例中,男女性发病数比为1 ∶ 1.34(365/489);发病年龄以青壮年占多数,15~59岁组占总病例数的83.61%,最小1岁,最大81岁。职业以干部职员(26.11%)为主,其次为商业服务者(20.49%)和家务及待业人员(16.04%)(表 1)。病例主要集中在2014年9月22日至10月21日出现,期间共累计报告680例(79.63%),平均每天报告病例21.94例(图 1)。854例病例中,91.33%(780/854)为本土患者,8.67%(74/854)为输入性病例;广西所辖14个市中,3个市同时报告本地病例和输入病例,9个市只有输入病例报告,2个市无病例报告。报告的74例输入性病例中,其中3例来自泰国病例输入中国南宁市(6月20日报告);67例来自广东省,只有1例于9月23日前输入至桂林市,其余66例于9月28日至11月12日期间输入;4例从广西南宁市输出(表 2)。
2. DENV NS1抗原检测:对收集的862例疑似登革热病例急性期血清标本862份进行DENV NS1抗原检测,阳性712份。
3. DENV血清分型:应用RT-PCR方法对526份DENV NS1抗原阳性血清标本进行DENV血清分型,414份分型阳性,其中DENV-1血清型345份(83.33%),DENV-2血清型69份(16.67%),未检出DENV-3血清型、DENV-4血清型。
4. DENV-1的E基因核苷酸序列分析:对DENV-1检测阳性标本进行E基因序列测定,共获得120条E基因序列(1 485 bp),核苷酸序列一致性为90.90%~100.00%,未发现核苷酸插入或缺失。114条序列来自南宁市本地病例,其中113条序列与新加坡2013年分离的登革毒株(SG EHI D1/529Y13,KJ806952)核苷酸序列一致性最高,为100.00%;与马来西亚、缅甸、泰国及中国广东省2014年同期分离的DENV-1毒株序列一致性为90.62%~97.33%;6条序列来自输入性病例,其中2条序列来自泰国输入性病例(6月20日报告),4条序列来自中国广东省输入性病例,与南宁市本地病例核苷酸序列一致性分别为96.85%和90.90%~97.30%。
根据E基因核苷酸序列一致性和标本采集时间,选取9条南宁市本地病例序列为代表,6条输入性病例序列以及从NCBI下载不同国家、地区DENV-1的E基因核苷酸序列,以DENV-2、DENV-3和DENV-4为外株,构建NJ进化树。结果显示,2014年广西登革热疫情中的DENV-1存在2种基因型:Ⅰ型和Ⅴ型,其中基因Ⅰ型分为3个分支,来自中国南宁市本地病例的序列在同一分支上(clade 1),与新加坡毒株亲缘性最高,同属基因Ⅰ型;2例泰国输入性病例是中国南宁市最早报告的输入性病例(2014年6月20日报告),其序列(DNEV-1/GXNN/2014004Thailand和DNEV-1/GXNN/2014005 Thailand)在进化树上与来自泰国的毒株在同一分支上(clade 3);从广东输入的4例病例序列分别来自北海、河池和梧州市报告的输入性病例,与2014年广东省登革疫情流行株共同分布在基因Ⅰ型clade 2和基因Ⅴ型分支上(图 2)。
5. DENV-2的E基因核苷酸序列分析:测序获得40条梧州市本地病例E基因序列,长1 485 bp,序列一致性为100.00%;在NCBI进行比对,与广东2014年DENV-2分离株(D14005)同源型最高,E基因核苷酸一致性为99.80%;NCBI中只收录1条广西1987年登革热疫情中分离的毒株43(AF204178),梧州市本地病例与毒株43的核苷酸序列一致性仅为94.21%。从NCBI下载DENV-2的E基因序列,序列按照分离时间、地点和核苷酸一致性进行筛选,选取3条梧州市本地病例序列和100株NCBI下载的DENV-2序列,构建E基因NJ进化树。结果显示,毒株43属于Asian-2基因型,梧州市本地病例序列与其不在同一分支上,而是与2014广东分离株最近,在同一分支,属于Cosmopolitan基因型(图 3)。
讨论
DENV分为4种血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4),不同国家和地区流行的DENV具有基因型和序列地域特异性,可作为登革热病原溯源的主要依据[18]。广西曾报告DENV-2和DENV-3引起的登革热疫情暴发,1980年发生第一次登革热暴发流行主要由DENV-3引起,1986年暴发的第二次登革热疫情病原为DENV-2[16],2014年广西报告第三次本地登革热暴发疫情,经实验证实由DENV-1和DENV-2同时引起。其中DENV-1首次在广西引起登革热暴发流行,83.25%(345/414)的血清分型阳性病例标本中检测到DENV-1核酸,是此次登革热疫情的主要病原;在中国南宁市本地登革热病例中同时检测到基因Ⅰ型和Ⅴ型两种基因型,99.12%(113/114)来自南宁市本地病例的序列和2014年6月20日报告的2例从泰国输入病例的序列均属于基因Ⅰ型,但在进化树上位于不同的分支上,其中泰国输入病例的序列位于基因Ⅰ型clade 3分支上,而113例中国南宁市本地病例的序列与来自新加坡2013年的流行株单独成一个分支(clade 1),可见南宁市本地登革热疫情病原可能来源于新加坡,6月20日报告的泰国输入病例并未引起传播。来自梧州市40例病例具有共同的E基因序列,与广西1987年登革热疫情中分离的DENV-2毒株43在不同的分支上,而是与广东2014年登革热疫情中分离到的DENV-2毒株(D14005)一致性最高,并在进化树同一分支上,说明梧州市登革热疫情的病原可能从广东省输入。
本次暴发共发现74例输入性病例,其中67例(90.54%)来自广东,3例(4.05%)来自泰国,其他县区从南宁市输入4例(5.40%)。能追溯的首例输入病例是2014年6月13日来自泰国的病例,但流行病学调查和基因序列分析结果表明,该输入病例并未引起本地登革热疫情传播;8月19日最早报告的本地病例所携带的病毒传播导致了此次暴发疫情,其病毒可能由新加坡等东南亚国家输入,但不能追溯到首例输入病例,无法确定本土病例和来自新加坡或马来西亚输入性病例/媒介在此次暴发之间的联系。此情况和2014年广东省登革热暴发疫情类似[19],提示应加大对出入境人员登革热监测力度,尽早发现输入性病例;加强登革热流行病学和病原学监测,开展更为深入的现场调查,评估蚊媒繁殖动态等措施暴露DENV的传播关系。
登革热的潜伏期为3~15 d。病例于9月22日至10月21日集中出现,11月初后病例报告显著下降,12月8日后不再有病例报告。此次疫情得到有效控制的原因,除了考虑采取了防蚊灭蚊等措施外,也需要考虑11月初气温下降导致的蚊媒活动度减少以及蚊媒密度降低的原因[20]。另外,从首例本土病例出现到采取积极防控措施需要34 d,从采取积极防控措施到疫情显著下降需要超过45 d(3个最长潜伏期),提示要加强临床医生对登革热病例诊断、报告意识;加大病例报告地区的防控措施,加强国际协作,对减少广西登革热疫情暴发、降低疫情规模将大有裨益。
综上所述,推测2014年广西登革热暴发疫情存在两条不同的传播链,从中国广东省输入的Cosmopolitan基因型DENV-2引起了梧州市登革热本土传播,而来自新加坡的基因Ⅰ型DENV-1则引起中国南宁市本土登革热疫情暴发。在登革热高度易感地区,单个输入的病例便可引发流行[5]。广西是登革热暴发流行高风险地区,东与中国广东省交界,南与越南接壤,需警惕再次发生由输入性病例或媒介引起本地登革热暴发流行。
本研究有局限性。DENV血症期较短,发病5 d后采集的血液标本中DENV核酸检出率低于45.8%[21],本文只对526例发病5 d内采集的病例血液标本进行病毒血清分型,阳性率仅为48.48%,但不影响对疫情主要病原型别和来源的判断。另外,由于各种原因未能追溯到首例输入病例,以及NCBI中收录的近几年越南、泰国等东南亚国家DENV序列较少,无法确定本土病例和来自新加坡或马来西亚等国家输入性病例/媒介在此次暴发之间的联系。