中华流行病学杂志  2016, Vol. 37 Issue (8): 1142-1147 |
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近年来，我国HIV/AIDS病例数逐年上升，HIV感染途径也逐渐变化。异性传播和男男同性传播是HIV感染的主要途径，其中男男同性传播呈快速上升趋势。新的重组毒株不断出现，耐药毒株流行，大大增加了HIV传播的风险。2015年1－10月天津市新报告HIV/AIDS有560例，较2014年的413例增长35.59%。为此本研究应用分子生物学技术探索天津市HIV流行株亚型分布、重组和耐药株传播和流行趋势。
材料与方法1. 样本及其处理：2015年天津市艾滋病确证中心实验室新确认的未经抗病毒治疗且CD4＋T淋巴细胞计数≥200个/μl的HIV感染者共505例，其中按不同感染途径分层随机抽样，共抽取样本77例，在知情同意的情况下，采集EDTA抗凝全血4～8 ml，离心分离血浆分装后，-80 ℃保存备用。
2. 核酸提取和基因序列扩增：采用德国Qiagen公司Viral RNA Extraction Kit提取感染者血浆中的病毒RNA，大连宝生物工程有限公司One-step RNA PCR Kit（AMV）反转录RT-PCR和巢式PCR扩增HIV-1的env和pol基因区，引物和反应条件见表 1。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，QIAGEN公司QIAquick gel extraction kit切胶纯化，使用ABI PRISM 3730XL进行测序。
3. 序列分析：从Los Alamos Database HIV数据库中下载各亚型的参考序列，Vector NTI 8.0软件包中Contig Express软件和BioEdit软件对原始序列进行拼接、比对和质量控制，Mega 6.0软件进行Neighbor-Joining系统进化分析（Bootstrap分析重复1 000次），可疑样本重新采血检测以排除实验污染的可能性。美国洛斯阿拉莫斯国家实验室HIV核酸序列库（http://www.HIV.lanl.gov）的BLAST工具进行亚型和序列比对分析。对各亚型进化树内的传播对进行分析，Bootstrap值≥80%提示有可疑传播关系，Bootstrap值＜80%但在一个独立的分支上判定为无法确定传播关系，两条序列不聚集且被其他序列分开则判定为无传播关系[1]，并结合后期流行病学调查进行综合分析。以HXB2做参考株，jpHMM-HIV在线软件（http://www.HIV.lanl.gov）进行HIV序列重组断点分析。经整理合格的pol基因用美国斯坦福大学HIV耐药数据库中的Calibrated Population Resistance（CPR）工具进行传播性耐药分析，并将序列提交Stanford HIV Drug Resistance Database （http://hivdb.Stan-ford.edu）进行亚型耐药分析。
4. 统计学分析：SPSS软件进行统计学分析，χ2检验比较不同传播途径的亚型分布差异，P＜0.05判断为差异具有统计学意义。
结 果1. 样本特征和亚型分布：77例HIV感染者中，最终扩增得到57条pol区和58条env区基因序列，两区结果综合分析后，共获得63份样本的亚型信息（其中52例样本均扩增出两区；5例只扩出pol区；6例只扩出env区）。男性占96.10%（74/77），女性占3.90%（3/77）；年龄12～58岁，平均（33±10）岁；未婚者占54.55%（42/77）；高中以上文化程度者占74.03%（57/77）；汉族占89.61%（69/77）；感染途径为男男同性传播占76.62%（59/77），异性传播占18.18%（14/77），静脉吸毒占3.90%（3/77），垂直传播占1.30%（1/77）。
HIV流行株亚型依次为CRF01_AE占46.03%（29/63），CRF07_BC占30.16%（19/63），B亚型占11.11%（7/63），CRF55_01B亚型占4.76%（3/63）其他独特型二代重组亚型（URF）占7.94%（5/63）。URF包括3例AE/BC、1例AE/B和1例新型重组亚型AE/B/C（表 2）。所有感染者中除7例为B亚型毒株外其他均为重组毒株，重组毒株的构成比为88.89%（56/63）。不同感染途径的亚型分布特点为：48例MSM中，以CRF01_AE为主占45.84%（22/48），其次为CRF07_BC占25.00%（12/48），B亚型占14.58%（7/48），CRF55_01B亚型占6.25%（3/48），URF占8.33%（4/48）；12例异性传播感染者中CRF01_AE占50.00%（6/12）、CRF07_BC占41.67%（5/12）和URF占8.33%（1/12），无B和CRF55_01B亚型，与MSM的亚型分布的差异无统计学意义（P＞0.05）；2例静脉吸毒感染者均为CRF07_BC亚型；1例垂直传播途径感染者为CRF01_AE。
2. URF的重组特点：8例URF中，MSM共7例（CRF55_01B 3例，AE/BC 2例，AE/B 1例及AE/B/C新型重组1例）；异性传播途径感染者中AE/BC重组1例。重组断点分析结果显示，3例AE/BC重组者pol区为CRF07_BC，env区为CRF01_AE ，两区内均未发现重组断点；1例AE/B 重组者pol区为CRF01_AE，env区为B亚型，两区内均未发现重组断点；3例01_B亚型的pol区发生了CRF01_AE和B亚型重组，env区为未发生重组的CRF01_AE，且TJ15M09和TJ15M11的重组断点基本一致；1例新型重组亚型TJ15M21的pol区出现了AE、B和C亚型的重组，env区为未发生重组的CRF07_BC（表 3）。
3. 耐药毒株流行情况：根据WHO公布的2009版监测性耐药突变名录（http://cpr.standford.edu/cpr.cgi），共发现3例监测性耐药突变感染者，其突变位点均为L100I，传播耐药率为5.3%（3/57），略高于WHO提出的5%的中度流行警戒线[2]，属于中度流行。应用美国斯坦福大学HIV基因型耐药分析数据库（http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra）对其他耐药突变位点进一步分析显示（表 4），非核苷酸反转录酶抑制剂（NNRTI）耐药突变者7例，为EFV/ETR/NVP/RPV潜在低度耐药，依次为V179E 3例（CRF55_01B亚型2例和CRF07_BC亚型1例）、V179D 2例（CRF07_BC亚型）、K238NS 1例（B亚型）、和H221Y 1例（AE/B）；蛋白酶抑制剂（PI）次要突变者8例，4例L10I/V突变者（均为CRF01_AE亚型），4例A71AT/AV/T突变者（均为CRF07_BC或B亚型），未发现对PI耐药。
4. 进化及传播关系：CRF01_AE主要分为2簇，均呈相对散在分布，以同性和异性传播者为主，CRF01_AE（1）内有1个可疑传播对（TJ15M03/TJ15H03）；CRF07_BC亚型分为2簇，均以性传播为主，静脉吸毒者均聚集在CRF07_BC（2），2簇各有可疑传播对1对（TJ15H01/TJ15M53和TJ15M28/TJ15H15）；B亚型呈高度聚集，均为男男同性传播，内有1个可疑传播对（TJ15M08/TJ15M17）；01_B亚型仅有的3例聚集，均为MSM，内有1个可疑传播对（TJ15M09/TJ15M11）。见图 1。
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| 图 1 2015年天津市HIV流行株pol区序列Neighber-Joining进化树分析 |
pol区Bootstrap值≥80%可疑传播对分析结果显示（表 5），TJ15H01/TJ15M53的env区未发生聚集而排除传播关系，TJ15M09/TJ15M11的pol区具有相同的NNRTI耐药位点，但由于env区Bootstrap值过低因此无法确定传播关系。3对TJ15M08/TJ15M17、TJ15M28/TJ15H15和TJ15M03/TJ15H03样本其pol区Bootstrap值均≥98%，env区均Bootstrap值≥80%，pol区平均基因距离为0.009，env区为0.086，耐药突变位点情况一致，且经后期调查发现每对内的感染者均维持超1年以上的同伴关系，可确认有传播关系。其中TJ15M28/TJ15H15中的TJ15M28是在TJ15H15感染后3个月发现的；其他两对中TJ15M08和TJ15M03确认HIV阳性后分别在第一时间对同伴TJ15M17和TJ15H03进行告知，经检测证实TJ15M17和TJ15H03的HIV感染，因此对内感染者确证时间不超过10 d。
本研究显示，天津市HIV感染者流行的亚型依次为CRF01_AE占46.03%（29/63），CRF07_BC占30.16%（19/63），B亚型占11.11%（7/63），CRF55_01B亚型占4.76%（3/63），其他CRF占7.94%（5/63）。性传播以CRF01_AE和CRF07_BC重组亚型为主，同性和异性传播的亚型分布无明显差别；静脉吸毒者均为CRF07_BC亚型；1例垂直传播者为CRF01_ AE。首次发现URF共8例，其中3例CRF55_01B亚型、2例AE/BC重组、1例AE/B重组和1例新型的AE/B/C重组亚型均为MSM；1例AE/BC重组为异性传播途径感染者。除MSM中有7例为B亚型外，其他途径感染者均为重组亚型毒株感染，天津市HIV感染者中重组毒株的构成比为88.89%，其中URF占12.70%，流行形势严峻。
二代重组毒株是多种毒株共感染或超感染的产物，是复杂的免疫环境中优势选择的结果，较单一的基因亚型或重组亚型的适应性更强，更容易在人群中传播[3-4]。亚型重组断点分析结果显示，首次发现的4例区内重组样本的重组断点均出现在pol区而env区未发生重组，提示pol区较env区可能更易发生重组。3例MSM的CRF55_01B亚型毒株pol区发生了CRF01_AE和B亚型重组，大大增加了新型二代重组毒株的传播风险。
目前天津市HIV抗病毒治疗仍以一线治疗方案为主。本研究发现，天津市HIV感染者传播耐药率为5.3%（3/57），略高于WHO提出的5%的中度流行警戒线，属于中度流行，3个SDRM感染者的突变位点均为NNRTI的L100I。其他耐药突变位点分析中发现，7例样本有NNRTI类潜在低度耐药，未发现NRTI和PI主要突变位点。研究还发现携带NNRTI类突变K238NS和V179D/E的毒株均为B亚型或含有B亚型序列的重组毒株；一些PI次要突变对PI主要耐药位点具有重要的协同作用，如L10I/V、A71V/T等[5-6]，本研究中8例PI辅助性耐药突变的感染者，携带L10I/V突变者均为CRF01_AE亚型，携带A71V/T突变者均为B亚型或含有B亚型序列的重组毒株，从毒株的亚型和耐药突变特点来看，NNRTI耐药突变和PI次要突变位点可能与其亚型有关。
本研究分析TJ15M08/TJ15M17、TJ15M28/TJ15H15和TJ15M03/TJ15H03样本对结果显示，pol区Bootstrap值均≥98%和env区Bootstrap值均≥80%以上的传播对结合流行病学调查可确认其传播关系。这3对样本的pol区平均基因距离为0.009，env区为0.086，与2015年文献报道的家庭内传播结果（pol区平均基因距离为0.010）基本一致[7]，考虑到3个传播对均涉及MSM人群，且该人群性行为活跃，其毒株变异率可能会受到行为学因素的影响，因此其具体标准有待加大样本量后进行深入研究。进化分析中发现，有传播关系的TJ15M03/TJ15H03 和TJ15M28/ TJ15H15样本对，其TJ15H03和TJ15H15经后期调查证实为男男性传播。相反TJ15M18/ TJ15M24前期调查认定为同伴关系，但进化分析后pol区Bootstrap值为55%且env区未发生聚集，因此排除其传播关系。TJ15M09/TJ15M11中2名MSM均为CRF55_01B亚型，具有相同的NNRTI耐药位点且pol区Bootstrap值均≥80%，但由于其env区Bootstrap值过低无法确定传播关系，调查也未发现直接或间接传播关系，该毒株很可能已在MSM中传播，其来源有待进一步研究。
综上所述，2015年天津市HIV感染者重组毒株不断增加并广泛流行，以同性和异性传播为主，性传播者中HIV新型二代重组和耐药毒株不断产生并在不同人群和不同地区间传播，应引起高度重视。
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表1(Table 1)
