中华流行病学杂志  2016, Vol. 37 Issue (8): 1142-1147   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2016.08.018
中华医学会主办。
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郑敏娜, 宁铁林, 高永军, 赵璇, 李龙, 程绍辉 .
Zheng Minna, Ning Tielin, Gao Yongjun, Zhao Xuan, Li Long, Cheng Shaohui .
天津市2015年HIV流行和传播的分子流行病学特征分析
Molecular epidemiology and transmission of HIV in Tianjin, 2015
中华流行病学杂志, 2016, 37(8): 1142-1147
CHINESE JOURNAL OF EPIDEMIOLOGY, 2016, 37(8): 1142-1147
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2016.08.018

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收稿日期: 2016-05-09
天津市2015年HIV流行和传播的分子流行病学特征分析
郑敏娜1, 宁铁林1, 高永军2, 赵璇1, 李龙1, 程绍辉1     
1. 300011天津市疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制所;
2. 300132 天津市红桥区疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制所
摘要: 目的 了解2015年天津市HIV流行株的亚型分布和传播特点。 方法 从77例新报告未治疗且CD4+T淋巴细胞计数≥200个/μl的HIV-1感染者,提取血浆中RNA,应用反转录和巢式PCR扩增HIV的pol和env区,并测序进行相关分子生物学分析。 结果 共获得63例样本的HIV毒株序列结果,亚型依次为CRF01_AE、CRF07_BC、B、CRF55_01B和其他独特型二代重组毒株,分别占46.03%(29/63)、30.16%(19/63)、11.11%(7/63)、4.76%(3/63)和7.94%(5/63);感染者以性传播为主,其中又以CRF01_AE和CRF07_BC重组亚型为主,除异性传播无B和CRF55_01B亚型外,同性和异性传播者的亚型分布无明显差别。重组毒株的构成比为88.89%(56/63),并首次发现的二代重组亚型8例,包括3例CRF55_01B、2例AE/BC、1例AE/B和1例新型的AE/B/C重组均为男男同性传播;1例AE/BC重组为异性传播。HIV感染者中传播耐药率为5.3%,均为NNRTI类监测性耐药突变L100I;进化分析中3对pol区Bootstrap值均≥98%,env区Bootstrap值均≥80%,调查显示3对样本来源确认有性伴传播关系。 结论 天津市HIV感染者中重组毒株不断增加并广泛流行,性传播者中HIV新型二代重组和耐药毒株不断产生并在不同人群和不同地区间传播,应引起高度重视。
关键词艾滋病病毒     亚型     耐药     系统进化分析    
Molecular epidemiology and transmission of HIV in Tianjin, 2015
Zheng Minna1, Ning Tielin1, Gao Yongjun2, Zhao Xuan1, Li Long1, Cheng Shaohui1     
1. Department for AIDS/STD Control and Prevention, Tianjin Center for Disease Control and Prevention, Tianjin 300011, China;
2. Department for AIDS/STD Control and Prevention, Hongqiao Districtal Center for Disease Control and Prevention, Tianjin 300132, China
Abstract: Objective To understand the characteristics on the diversity of HIV subtypes and related transmission in Tianjin. Methods A total of 77 newly diagnosed ART-naïve HIV infectors in 2015 were screened by CD4+T cell counts≥200 cells/μl. Viral RNAs were extracted from plasma samples. Reverse transcription PCR and nested PCR were used to analyze the amplification of pol and env gene fragments, sequencing, and related bioinformatics information. Results 46.03% (29/63), 30.16% (19/63), 11.11% (7/63), 4.76% (3/63) and 7.94% (5/63) of the individuals were infected under HIV subtypes CRF01_AE, CRF07_BC, B, CRF55_01B and URFs, with sexual transmission as the major mode of infection. CRF01_AE and CRF07_BC strains were predominant in both MSM and HST populations. The patterns of subtype distribution did not show statistical differences other than subtype B and CRF55_01B strain among HSTs. The proportion of CRFs increased significantly to 88.89%. 8 new second-generation recombinant forms were identified the first time, including 3 CRF55_01B, 2 AE/BC, 1 AE/B and 1AE/B/C among MSMs and 1 AE/BC among HSTs. 5.3% of the NNRTI L100I HIV infectors transmitted the drug-resistant-mutation strain. 3 linkages related to HIV transmission were confirmed through phylogenetic analysis with Bootstrap ≥98% of pol and ≥80% of env. Conclusion The increasing complexity of HIV had been noticed in Tianjin, including the prevalence and transmission of second-generation recombinant and drug-resistant strains through different routes of transmission and in different regions.
Key words: Human immunodeficiency virus     Subtype     Drug-resistance     Phylogenetic analysis    

近年来,我国HIV/AIDS病例数逐年上升,HIV感染途径也逐渐变化。异性传播和男男同性传播是HIV感染的主要途径,其中男男同性传播呈快速上升趋势。新的重组毒株不断出现,耐药毒株流行,大大增加了HIV传播的风险。2015年1-10月天津市新报告HIV/AIDS有560例,较2014年的413例增长35.59%。为此本研究应用分子生物学技术探索天津市HIV流行株亚型分布、重组和耐药株传播和流行趋势。

材料与方法

1. 样本及其处理:2015年天津市艾滋病确证中心实验室新确认的未经抗病毒治疗且CD4T淋巴细胞计数≥200个/μl的HIV感染者共505例,其中按不同感染途径分层随机抽样,共抽取样本77例,在知情同意的情况下,采集EDTA抗凝全血4~8 ml,离心分离血浆分装后,-80 ℃保存备用。

2. 核酸提取和基因序列扩增:采用德国Qiagen公司Viral RNA Extraction Kit提取感染者血浆中的病毒RNA,大连宝生物工程有限公司One-step RNA PCR Kit(AMV)反转录RT-PCR和巢式PCR扩增HIV-1的envpol基因区,引物和反应条件见表 1。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,QIAGEN公司QIAquick gel extraction kit切胶纯化,使用ABI PRISM 3730XL进行测序。

表 1 反转录结合巢式PCR法扩增HIV-1的polenv基因区的引物和反应条件

3. 序列分析:从Los Alamos Database HIV数据库中下载各亚型的参考序列,Vector NTI 8.0软件包中Contig Express软件和BioEdit软件对原始序列进行拼接、比对和质量控制,Mega 6.0软件进行Neighbor-Joining系统进化分析(Bootstrap分析重复1 000次),可疑样本重新采血检测以排除实验污染的可能性。美国洛斯阿拉莫斯国家实验室HIV核酸序列库(http://www.HIV.lanl.gov)的BLAST工具进行亚型和序列比对分析。对各亚型进化树内的传播对进行分析,Bootstrap值≥80%提示有可疑传播关系,Bootstrap值<80%但在一个独立的分支上判定为无法确定传播关系,两条序列不聚集且被其他序列分开则判定为无传播关系[1],并结合后期流行病学调查进行综合分析。以HXB2做参考株,jpHMM-HIV在线软件(http://www.HIV.lanl.gov)进行HIV序列重组断点分析。经整理合格的pol基因用美国斯坦福大学HIV耐药数据库中的Calibrated Population Resistance(CPR)工具进行传播性耐药分析,并将序列提交Stanford HIV Drug Resistance Database (http://hivdb.Stan-ford.edu)进行亚型耐药分析。

4. 统计学分析:SPSS软件进行统计学分析,χ2检验比较不同传播途径的亚型分布差异,P<0.05判断为差异具有统计学意义。

结 果

1. 样本特征和亚型分布:77例HIV感染者中,最终扩增得到57条pol区和58条env区基因序列,两区结果综合分析后,共获得63份样本的亚型信息(其中52例样本均扩增出两区;5例只扩出pol区;6例只扩出env区)。男性占96.10%(74/77),女性占3.90%(3/77);年龄12~58岁,平均(33±10)岁;未婚者占54.55%(42/77);高中以上文化程度者占74.03%(57/77);汉族占89.61%(69/77);感染途径为男男同性传播占76.62%(59/77),异性传播占18.18%(14/77),静脉吸毒占3.90%(3/77),垂直传播占1.30%(1/77)。

HIV流行株亚型依次为CRF01_AE占46.03%(29/63),CRF07_BC占30.16%(19/63),B亚型占11.11%(7/63),CRF55_01B亚型占4.76%(3/63)其他独特型二代重组亚型(URF)占7.94%(5/63)。URF包括3例AE/BC、1例AE/B和1例新型重组亚型AE/B/C(表 2)。所有感染者中除7例为B亚型毒株外其他均为重组毒株,重组毒株的构成比为88.89%(56/63)。不同感染途径的亚型分布特点为:48例MSM中,以CRF01_AE为主占45.84%(22/48),其次为CRF07_BC占25.00%(12/48),B亚型占14.58%(7/48),CRF55_01B亚型占6.25%(3/48),URF占8.33%(4/48);12例异性传播感染者中CRF01_AE占50.00%(6/12)、CRF07_BC占41.67%(5/12)和URF占8.33%(1/12),无B和CRF55_01B亚型,与MSM的亚型分布的差异无统计学意义(P>0.05);2例静脉吸毒感染者均为CRF07_BC亚型;1例垂直传播途径感染者为CRF01_AE。

表 2 不同感染途径的HIV亚型分布特点

2. URF的重组特点:8例URF中,MSM共7例(CRF55_01B 3例,AE/BC 2例,AE/B 1例及AE/B/C新型重组1例);异性传播途径感染者中AE/BC重组1例。重组断点分析结果显示,3例AE/BC重组者pol区为CRF07_BC,env区为CRF01_AE ,两区内均未发现重组断点;1例AE/B 重组者pol区为CRF01_AE,env区为B亚型,两区内均未发现重组断点;3例01_B亚型的pol区发生了CRF01_AE和B亚型重组,env区为未发生重组的CRF01_AE,且TJ15M09和TJ15M11的重组断点基本一致;1例新型重组亚型TJ15M21的pol区出现了AE、B和C亚型的重组,env区为未发生重组的CRF07_BC(表 3)。

表 3 HIV流行株URF的jpHMM-HIV重组断点分析结果

3. 耐药毒株流行情况:根据WHO公布的2009版监测性耐药突变名录(http://cpr.standford.edu/cpr.cgi),共发现3例监测性耐药突变感染者,其突变位点均为L100I,传播耐药率为5.3%(3/57),略高于WHO提出的5%的中度流行警戒线[2],属于中度流行。应用美国斯坦福大学HIV基因型耐药分析数据库(http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra)对其他耐药突变位点进一步分析显示(表 4),非核苷酸反转录酶抑制剂(NNRTI)耐药突变者7例,为EFV/ETR/NVP/RPV潜在低度耐药,依次为V179E 3例(CRF55_01B亚型2例和CRF07_BC亚型1例)、V179D 2例(CRF07_BC亚型)、K238NS 1例(B亚型)、和H221Y 1例(AE/B);蛋白酶抑制剂(PI)次要突变者8例,4例L10I/V突变者(均为CRF01_AE亚型),4例A71AT/AV/T突变者(均为CRF07_BC或B亚型),未发现对PI耐药。

表 4 HIV感染者的耐药相关突变位点和药物敏感性分析

4. 进化及传播关系:CRF01_AE主要分为2簇,均呈相对散在分布,以同性和异性传播者为主,CRF01_AE(1)内有1个可疑传播对(TJ15M03/TJ15H03);CRF07_BC亚型分为2簇,均以性传播为主,静脉吸毒者均聚集在CRF07_BC(2),2簇各有可疑传播对1对(TJ15H01/TJ15M53和TJ15M28/TJ15H15);B亚型呈高度聚集,均为男男同性传播,内有1个可疑传播对(TJ15M08/TJ15M17);01_B亚型仅有的3例聚集,均为MSM,内有1个可疑传播对(TJ15M09/TJ15M11)。见图 1

图 1 2015年天津市HIV流行株pol区序列Neighber-Joining进化树分析

pol区Bootstrap值≥80%可疑传播对分析结果显示(表 5),TJ15H01/TJ15M53的env区未发生聚集而排除传播关系,TJ15M09/TJ15M11的pol区具有相同的NNRTI耐药位点,但由于env区Bootstrap值过低因此无法确定传播关系。3对TJ15M08/TJ15M17、TJ15M28/TJ15H15和TJ15M03/TJ15H03样本其pol区Bootstrap值均≥98%,env区均Bootstrap值≥80%,pol区平均基因距离为0.009,env区为0.086,耐药突变位点情况一致,且经后期调查发现每对内的感染者均维持超1年以上的同伴关系,可确认有传播关系。其中TJ15M28/TJ15H15中的TJ15M28是在TJ15H15感染后3个月发现的;其他两对中TJ15M08和TJ15M03确认HIV阳性后分别在第一时间对同伴TJ15M17和TJ15H03进行告知,经检测证实TJ15M17和TJ15H03的HIV感染,因此对内感染者确证时间不超过10 d。

表 5 Bootstrap值与可疑传播的关系分析
讨 论

本研究显示,天津市HIV感染者流行的亚型依次为CRF01_AE占46.03%(29/63),CRF07_BC占30.16%(19/63),B亚型占11.11%(7/63),CRF55_01B亚型占4.76%(3/63),其他CRF占7.94%(5/63)。性传播以CRF01_AE和CRF07_BC重组亚型为主,同性和异性传播的亚型分布无明显差别;静脉吸毒者均为CRF07_BC亚型;1例垂直传播者为CRF01_ AE。首次发现URF共8例,其中3例CRF55_01B亚型、2例AE/BC重组、1例AE/B重组和1例新型的AE/B/C重组亚型均为MSM;1例AE/BC重组为异性传播途径感染者。除MSM中有7例为B亚型外,其他途径感染者均为重组亚型毒株感染,天津市HIV感染者中重组毒株的构成比为88.89%,其中URF占12.70%,流行形势严峻。

二代重组毒株是多种毒株共感染或超感染的产物,是复杂的免疫环境中优势选择的结果,较单一的基因亚型或重组亚型的适应性更强,更容易在人群中传播[3-4]。亚型重组断点分析结果显示,首次发现的4例区内重组样本的重组断点均出现在pol区而env区未发生重组,提示pol区较env区可能更易发生重组。3例MSM的CRF55_01B亚型毒株pol区发生了CRF01_AE和B亚型重组,大大增加了新型二代重组毒株的传播风险。

目前天津市HIV抗病毒治疗仍以一线治疗方案为主。本研究发现,天津市HIV感染者传播耐药率为5.3%(3/57),略高于WHO提出的5%的中度流行警戒线,属于中度流行,3个SDRM感染者的突变位点均为NNRTI的L100I。其他耐药突变位点分析中发现,7例样本有NNRTI类潜在低度耐药,未发现NRTI和PI主要突变位点。研究还发现携带NNRTI类突变K238NS和V179D/E的毒株均为B亚型或含有B亚型序列的重组毒株;一些PI次要突变对PI主要耐药位点具有重要的协同作用,如L10I/V、A71V/T等[5-6],本研究中8例PI辅助性耐药突变的感染者,携带L10I/V突变者均为CRF01_AE亚型,携带A71V/T突变者均为B亚型或含有B亚型序列的重组毒株,从毒株的亚型和耐药突变特点来看,NNRTI耐药突变和PI次要突变位点可能与其亚型有关。

本研究分析TJ15M08/TJ15M17、TJ15M28/TJ15H15和TJ15M03/TJ15H03样本对结果显示,pol区Bootstrap值均≥98%和env区Bootstrap值均≥80%以上的传播对结合流行病学调查可确认其传播关系。这3对样本的pol区平均基因距离为0.009,env区为0.086,与2015年文献报道的家庭内传播结果(pol区平均基因距离为0.010)基本一致[7],考虑到3个传播对均涉及MSM人群,且该人群性行为活跃,其毒株变异率可能会受到行为学因素的影响,因此其具体标准有待加大样本量后进行深入研究。进化分析中发现,有传播关系的TJ15M03/TJ15H03 和TJ15M28/ TJ15H15样本对,其TJ15H03和TJ15H15经后期调查证实为男男性传播。相反TJ15M18/ TJ15M24前期调查认定为同伴关系,但进化分析后pol区Bootstrap值为55%且env区未发生聚集,因此排除其传播关系。TJ15M09/TJ15M11中2名MSM均为CRF55_01B亚型,具有相同的NNRTI耐药位点且pol区Bootstrap值均≥80%,但由于其env区Bootstrap值过低无法确定传播关系,调查也未发现直接或间接传播关系,该毒株很可能已在MSM中传播,其来源有待进一步研究。

综上所述,2015年天津市HIV感染者重组毒株不断增加并广泛流行,以同性和异性传播为主,性传播者中HIV新型二代重组和耐药毒株不断产生并在不同人群和不同地区间传播,应引起高度重视。

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