2016, Vol. 37
文章信息
- 叶莉霞, 付朝伟, 江峰, 孟炜.
- Ye Lixia, Fu Chaowei, Jiang Feng, Meng Wei.
- 锌指蛋白基因IKZF3多态性与中国长江以南汉族人群系统性红斑狼疮的病例对照研究
- Association between IKZF3 gene polymorphisms and systemic lupus erythematosus in Han ethnic group in southern China: a case-control study
- 中华流行病学杂志, 2016, 37(7): 996-1002
- Chinese Journal of Epidemiology, 2016, 37(7): 996-1002
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2016.07.018
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文章历史
- 投稿日期: 2015-12-23
2. 315010 浙江省宁波市疾病预防控制中心免疫预防所
2. Institute of Immunological Prevention, Ningbo Prefecture Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315010, China
系统性红斑狼疮(SLE)系以多器官受累，多组织损害，高水平的自身抗体为特征的慢性全身性自身免疫性疾病[1, 2]。目前全球发病率为20/10万～150/10万[3]，以女性为主，亚洲地区人群的发病率较欧洲地区人群为高，且症状更为严重，其血清自身抗体水平更高[4, 5]，在我国是现阶段重要的公共卫生问题[6]。
IKZF3基因位于染色体17q21区域，包含9个外显子。其编码的Aiolos蛋白，是锌指蛋白家族成员。锌指蛋白家族是一组重要的转录因子，对T、B淋巴细胞以及自然杀伤细胞的发育具有重要作用。其中Aiolos蛋白对B淋巴细胞的活化起着至关重要的作用[7]。近年来，IKZF3基因被发现是多种免疫相关疾病的候选基因[8, 9, 10]。美国近期一项研究认为IKZF3多态性可能与SLE有关[11]。目前国内也有一项病例对照研究提示IKZF3 rs907091可能与SLE有关[12]。但国内外尚未见探讨IKZF3 多个单核苷酸多态性(SNP)位点与SLE发病以及临床表型关系的研究。为此本研究以中国长江以南地区汉族人群为研究对象，探讨IKZF3多个SNP位点对SLE发病和临床表型的影响。
对象与方法1. 研究对象：病例组213例，源自苏州大学第一附属医院、复旦大学附属中山医院、杭州市第三人民医院2005年10月至2009年6月住院及门诊SLE病例，均经专业皮肤科医生按照美国风湿病学会(ACR)1997年修订标准诊断[13]；对照组为同一时期在该医院体检、不患任何自身免疫疾病的人群共234例。所有纳入对象均为独立个体，无血缘关系，排除合并发生其他免疫相关疾病者。本研究通过复旦大学伦理委员会审查，调查对象均签署知情同意书。
2. SNP位点的选择：根据HapMap dbSNP数据库(www.hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)，采用HaploView 4.2软件，在IKZF3基因的上游4 000 bp到下游1 500 bp之间选择标签SNP(tagSNPs)rs907091、rs114509391、rs9909593、rs9635726。同时通过文献查阅，还发现rs1453559与免疫相关疾病哮喘有相关性，因此也将该位点纳入本研究。根据HapMap数据，5个SNP位点满足在中国人群的最小等位基因频率(MAF)均＞0.05。
3. 研究方法：采用结构式问卷，由经过统一培训的调查员进行面对面调查，内容包括一般人口学资料和既往环境暴露史，并利用医院的病例管理系统收集临床表型和免疫学表型资料。采集研究对象的外周静脉血5 ml，用EDTA抗凝，保存在-80 ℃冰箱；酚氯仿法提取DNA，分装后采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对IKZF3基因rs907091(C/T)、rs114509391(C/A)、rs9909593(G/A)、rs9635726(C/T)、rs1453559(G/A)位点进行基因分型。各位点的上下游引物、限制性内切酶以及酶切产物见表1。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火(退火温度依次为52 ℃、51.5 ℃、53.5 ℃、50 ℃、59 ℃)反应30 s，72 ℃反应30 s，循环33次；循环后，72 ℃延伸10 min。扩增产物使用限制性内切酶(依次为MspⅠ、DdeⅠ、BlpⅠ、HindⅡ和KpnⅠ)酶切，37 ℃水浴6 h；酶切产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳成像并判断分型。
4. 生物信息学分析：采用F-SNP、RegulomeDB、SNPinfo和PolymiRTS等多种综合生物信息数据库，对IKZF3基因的5个SNP位点进行潜在功能预测。①F-SNP(http://compbio.cs.queensu.ca/F-SNP/)：对基因多态位点在剪接、转录、翻译及翻译后水平的潜在功能进行预测[14]。②RegulomeDB(http://regulome.stanford.edu/)：整合ENCODE和其他数据库资源的分析结果，通过决策树方法对SNP引起的各种基因功能改变进行定量评估和危险度分级。RegulomeDB分值(1～6分)，分值越低，表示该SNP越有可能位于功能区域[15]。③SNPinfo(http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.htm)：利用对预测功能性位点的两个等位基因不同效应的计算、实验结果、流行病学资料以及GWAS的结果和连锁不平衡信息来对SNP位点进行优化，进一步对疾病致病位点进行精细定位[16]。④PolymiRTS：整合了SNP、整合序列多态性、表型和表达微阵列数据，对预测3′端SNP位点是否是microRNA 目标位点[17]。
5. 统计学分析：采用直接计数法计算基因型和等位基因频率，采用Plink 1.07软件，对各位点基因型进行Hardy-Weinberg(H-W)遗传平衡检验，进行不同遗传模型下(相加、隐性、显性模型)单因素、多因素logistic回归分析，研究IKZF3多态性与SLE之间的关系，并计算5个SNP位点的连锁不平衡情况分析(r2值)。在单纯病例研究中，采用多因素logistic回归分析，使用Stata 12.0软件，研究基因多态性与临床表型(包括器官损伤和血清免疫学指标)之间的相关性。采用HaploView 4.2软件和Plink 1.07软件进行连锁分析和单倍型分析。所有统计学检验均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果1. 基本情况： 病例组女性200例(93.90%，200/213)，对照组女性227例(97.01%，227/234)，两组间性别分布差异无统计学意义( χ2＝2.53，P＝0.108)；病例组平均年龄(35.35±11.85)岁，对照组平均年龄(33.17±11.25)岁，差异无统计学意义(t＝-1.93，P＝0.053)。共对183例病例(85.92%)和184例对照(78.63%)进行环境因素调查，其中冻疮史、居住环境潮湿、紫外线暴露史、药物过敏史、带状疱疹病史、荨麻疹病史和家族疾病史的分布，病例组高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。考虑到可能存在失访偏倚，对纳入环境因素调查人群和总研究人群的SNP基因型分布进行 χ2检验，结果显示两者分布的差异无统计学意义(P＞0.05)，提示纳入环境因素调查的人群对总研究人群有很好的代表性。所有SNP基因型分布均符合H-W遗传平衡(表3)，提示样本具有很好的代表性。
2. IKZF3基因多态性和SLE易感性相关性：
(1) 基因型及等位基因频率分布：IKZF3基因5个SNP位点的基因型及MAF分布见表3。rs114509391、rs9635726两位点基因型和MAF分布在病例组和对照组间的差异有统计学意义。对于 rs114509391，最小等位基因C的频率病例组低于对照组；基因型分布上，杂合子CA的频率病例组低于对照组，在显性模型下病例组和对照组的分布差异也有统计学意义(表3)。rs9635726的最小等位基因C频率病例组低于对照组；基因型分布上，加性和显性模型均显示，CC、CT基因型的频率病例组高于对照组。rs907091、rs9909593和rs1453559的基因型及MAF分布在病例组和对照组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。
(2) 多因素logistic回归分析：环境因素中可能存在潜在混杂因素，因此在相加、隐性、显性模型下，采用多因素logistic回归模型，调整年龄、性别和有统计学意义的危险环境因素(包括冻疮史、居住环境潮湿、药物过敏史、荨麻疹病史和家族疾病史)，分析IKZF3基因多态性与SLE易感性的相关性(表3)。结果显示，rs114509391位点的基因型在病例组和对照组中分布的差异有统计学意义，携带CA基因型的个体较携带AA基因型的个体患SLE的风险下降，显性模型也有统计学意义。其他4个SNP位点在所有的遗传模型下均未发现有统计学意义的关联。
随后根据临床表型进行分层分析。证实rs114509391、rs9635726两位点与SLE易感性的相关性。提示rs9909593、rs907091可能也与SLE存在相关性。抗SSB抗体阳性患者与对照组相比，携带rs9909593位点GG和GA基因型的个体，较AA基因型的个体而言，患SLE的风险降低(显性模型：OR＝0.31，95%CI：0.11～0.87，P＝0.026)；抗dsDNA抗体阴性患者与对照组相比，携带rs907091位点CC基因型的个体，较携带CT、TT基因型的个体，患SLE的风险增加(隐性模型：OR＝3.75，95%CI：1.08～12.99，P＝0.037)。
3. IKZF3基因多态性与SLE临床表型相关性：采用多因素logistic回归模型和单纯病例研究设计，在调整年龄、性别和有统计学意义的危险环境因素(包括冻疮史、居住环境潮湿、药物过敏史、荨麻疹病史和家族疾病史)后，比较某个临床表型阳性和阴性的患者，进一步对IKZF3多态性与SLE的临床表型(包括器官损伤和血清免疫学指标)的相关性进行了分析。结果显示，对于rs907091位点的基因型分布在有/无肾脏损害患者之间的差异有统计学意义(加性模型：OR＝0.59，95%CI：0.35～0.98，P＝0.043)，携带等位基因C的患者较等位基因T者，出现肾脏损害的风险降低；携带rs907091位点CC、CT基因型的患者出现抗SSB抗体阳性的风险，较TT基因型的患者降低(显性模型：OR＝0.41，95%CI：0.18～0.96，P＝0.040)。此外，对于rs9909593位点，携带GG、GA基因型的患者出现抗SSB抗体阳性的风险也较AA基因型患者下降(显性模型：OR＝0.37，95%CI：0.16～0.88，P＝0.025)。
4. 连锁不平衡和单倍型分析：连锁不平衡分析显示，rs907091与rs9909593之间存在连锁不平衡(r2＞0.8)，其他各SNP位点之间的r2值均＜0.6(图1)。在5个SNP的单倍型分析中，调整年龄、性别和有统计学意义的危险环境因素(包括冻疮史、居住环境潮湿、药物过敏史、荨麻疹病史和家族疾病史)后发现，单倍型TCATT(rs907091-rs114509391-rs9909593- rs9635726-rs1453559)在病例组的频率为2.04%，低于对照组的5.16%(P＝0.027)。
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| 图1 IKZF3基因连锁不平衡分析 注：方块中的值为2个SNP位点间的r2值(0～100)，其颜色越深代表r2值越大 |
5. 生物信息学分析：采用多种SNP功能预测网站，预测IKZF3基因5个SNP位点潜在功能(表4)。结果提示，rs907091是位于3′端非翻译区的MicroRNA结合位点，可结合hsa-miR-326、hsa-miR-330-5p和hsa-miR-450b-3p；RegulomeDB评分为1f，在人类外周血B细胞、T细胞起到强转录因子的作用。rs114509391是外显子，编码锌指蛋白Aiolos 亚型8；根据NCBI的蛋白数据库，该蛋白是调节B淋巴细胞增殖和分化的重要转录因子。rs9909593虽然是内含子，但是其RegulomeDB评分为1f，提示该位点是可能影响绑定与目标基因表达的功能位点，在人类外周血B细胞、T细胞和自然杀伤细胞均是起到了基因增强子的作用；并且rs9909593是一个保守位点，有较大的遗传学意义。rs9635726、rs1453559均为转录调控因子，且为保守位点，有遗传学意义；rs1453559的变异可能影响分子的剪接，从而改变其多种剪接方式的表达水平；rs9635726、rs1453559的Regulome DB评分均为4，在人类外周血B细胞、T细胞中是活跃的转录起始位点(TSS)。
SLE是一种由遗传因素和环境因素共同作用导致的复杂多因素疾病，其病因至今仍不明确。其中组织和器官的损伤，大量自身抗体产生、补体激活、免疫复合物沉积是其主要特征[1, 18]。
IKZF3基因是IKAROS家族转录因子，调节B淋巴细胞的发育和分化。动物实验研究提示，缺乏IKZF3基因的小鼠会出现B细胞功能障碍、自身抗体生产、组织损伤以及SLE症状[19]。此外，有研究表明，SLE患者Aiolos mRNA表达降低，且与SLE活动指数呈一定相关性[20]。提示IKZF3基因可能是SLE的候选基因。近年美国一项IKZF3多态性与SLE发病相关性研究认为IKZF3基因的rs9913957、rs8076347和rs8079075位点在亚洲人群中均无多态性[11]。近期Cai 等[12]在中国人群中的研究提示IKZF3基因的rs907091位点与SLE易感性相关。
本研究关联分析显示，IKZF3的rs114509391位点与SLE的发病有较强的关联性。但生物信息学分析显示，rs114509391是外显子，编码锌指蛋白Aiolos 亚型8，该蛋白在多项研究中被证实是调节B淋巴细胞增殖和分化的重要转录因子[21, 22]，而B细胞通路是SLE的重要致病机制之一[23, 24]。分层分析进一步提示rs9635726、rs9909593两位点可能与SLE的发病也存在关联。在Cai 等[12]的研究中也发现了rs9909593位点与SLE存在关联，与本研究结果一致。生物信息学分析进一步提示rs9909593虽是内含子，但影响绑定和目标基因的表达，在B、T细胞中起到基因增强子的作用；而rs9635726是转录调控因子，在B、T细胞中是活跃的转录起始位点。本研究与Cai等[12]的研究结果不一致的是，并未发现rs907091与SLE的发病存在相关性。然而，生物信息学分析结果提示rs907091是MicroRNA结合位点，其结合的miR-326被报道可能在多发性硬化症这种自身免疫性疾病中起到重要作用[25, 26]，提示rs907091可能在SLE的病理过程中起到一定作用。临床表型关联性研究中发现rs907091与肾脏损害和抗SSB抗体产生有关，也佐证了rs907091在SLE病理过程的作用。此外本研究还显示rs9909593位点与抗SSB抗体产生相关，可能是由于该位点作为基因增强子，在B细胞通路和抗体产生中起到了作用。单倍型分析显示，单倍型TCATT在病例组的频率较对照组低，可能是一个保护性因素。
总之，本研究通过病例对照研究设计，描述了对IKZF3基因不同功能区域的5个SNP位点与SLE的发病和临床表型间的关系。rs114509391、rs9635726和rs9909593可能与SLE易感性相关，rs9909593、rs907091与SLE的临床表型相关。但本研究仍存在不足。如研究对象仅为单一地区的汉族人群，由于民族、地域的差异，可能在其他人群中无法重复本文结果，有些关联尚与其他研究存在不一致；究其原因，可能是由于OR值较接近1，需要更大的样本量之故。所以今后有待于在不同民族、大样本人群中进一步验证。
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