鼠疫噬菌体寄生于鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌）。历史上鼠疫噬菌体曾用于鼠疫的治疗和预防^[1]。鼠疫噬菌体不仅可以鉴定鼠疫菌^[2]，外环境中发现鼠疫噬菌体也被认为是存在鼠疫菌的间接证据。国外研究者曾从鼠疫尸体、染疫动物死尸、恢复期患者粪便、动物排泄物、污水以及鼠疫菌陈旧培养物中分离出鼠疫噬菌体^{[2, 3]}。国内也曾有分离的报道^{[4, 5, 6]}。鼠疫噬菌体分为4个血清型，烈性噬菌体都属于血清Ⅰ型，血清Ⅱ～Ⅳ型都是溶原性噬菌体^[7]。

鼠疫噬菌体Yep-phi^[8]和PhiA1122^[9]分别是中国和美国CDC采用的诊断鼠疫噬菌体，二者均属于短尾噬菌体科，PhiA1122不仅裂解鼠疫菌，而且在37 ℃可裂解假结核耶尔森菌^[9]，而Yep-phi在20 ℃和37 ℃均特异裂解鼠疫菌，对耶尔森菌属的其他种不裂解^[8]。目前我国鼠疫监测中已经发现天然的抗现有鼠疫诊断噬菌体的鼠疫菌，这使得依靠鼠疫噬菌体的现行诊断体系受到极大挑战。本研究从云南省玉龙县鼠疫疫源地鼠巢中分离获得1株野生型鼠疫噬菌体，并对其形态、裂解特性、宿主谱、最佳感染复数、一步生长特性等生物学特性进行观察和描述。

1. 细菌：鼠疫疫苗株EV76、6株假结核耶尔森菌和 5株小肠结肠炎耶尔森菌、1株弗氏/中间耶尔森菌和1株克氏耶尔森菌为本实验室保存；另外1株克氏耶尔森菌和1株弗氏/中间耶尔森菌由中国CDC传染病预防控制所景怀琦研究员惠赠。

2. 培养基和试剂：实验用LB液体培养基、LB半固体培养基、LB固体培养基、噬菌体保存液（SM缓冲液）均按常规方法制备和保存。

3. 野生型鼠疫噬菌体的分离与纯化：①宿主菌株：鼠疫疫苗株EV76作为宿主菌置28 ℃ 120 r/min振荡培养20 h至对数生长期。②样本预处理：取云南省玉龙县黄山镇采集的鼠巢约5～6 g加入0.9%氯化钠注射液约30～35 ml，充分混匀、浸泡，4 ℃冰箱过夜。次日取上述浸泡液3 000×g离心10 min，收集上清，用0.22 μm微孔滤膜过滤处理，收集滤液。③样品原液中噬菌体的富集：将滤液中加入等体积2×LB液体培养基，然后接种对数生长期的鼠疫疫苗菌悬液300 μl，加入1 mol/L MgSO₄至终浓度为10 mmol/L，充分混匀，于28 ℃摇床120 r/min振荡培养20～24 h。上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，收集滤液。重复增殖一次。④鼠疫噬菌体的分离和纯化：取样品过滤液100 μl，加入对数生长期的鼠疫疫苗菌悬液100 μl，混合后室温放置10 min，加入到已融化至45 ℃ 6 ml LB半固体培养基中，轻轻振荡后倒入底层LB固体培养基中，置于28 ℃恒温培养箱，20～24 h后观察噬菌斑。挑取单斑置于1 ml SM液中4 ℃保存。噬菌体悬液10倍系列稀释后，按照上述双层琼脂平板法分离噬菌斑，重复5次得到纯化的鼠疫噬菌体。

4. 野生型鼠疫噬菌体的鉴定：① 效价测定：采用10倍系列稀释和双层琼脂平板法，培养20～24 h后计数噬菌体效价。噬菌体效价（PFU/ml）=平均噬菌斑数×稀释倍数×10。② 电镜下形态：用3 kDa规格离心超滤管浓缩后采用醋酸双氧铀负染色法处理^[10]，日立HT7700透射电子显像镜下观察。③ 最佳感染复数和一步生长曲线按文献测定^[11]。④ 宿主谱分析^[12]：16株耶尔森菌属菌测定分离的鼠疫噬菌体裂解谱，置28 ℃和37 ℃培养20～24 h后观察结果。⑤ 野生型鼠疫噬菌体的理化因素敏感性试验^{[12, 13]}：采用双层琼脂平板法测定温度、pH、紫外线、氯仿对噬菌体的敏感性。

1. 鼠疫噬菌斑的形态、大小及效价：从云南省玉龙县黄山镇采集的鼠巢中分离出1株以鼠疫疫苗株EV76为宿主菌的野生鼠疫噬菌体，命名为YP060。该鼠疫噬菌体形成的噬菌斑中心清晰，边缘模糊，直径约为0.9～1.2 mm，见图 1。通过液体增殖培养后，鼠疫噬菌体YP060效价达到10⁷ PFU/ml。

图 1 鼠疫噬菌体YP060噬菌斑形态（×1倍）

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2. 噬菌体形态：呈蝌蚪形，头部为正多面体结构，头部直径约为60 nm，尾部长约140 nm左右，有一收缩的尾鞘。根据Ackermann^{[14, 15]}的分类，该噬菌体归类于肌尾噬菌体（Myoviridae）A1群，见图 2。

图 2 鼠疫噬菌体YP060电镜下形态（×200 000倍）

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3. 最佳感染复数测定：当感染复数为0.1 时，噬菌体YP060感染宿主菌EV76后所产生的子代噬菌体的效价最高，因此该噬菌体的最佳感染复数为0.1。

4. 一步生长曲线： 野生型噬菌体YP060 潜伏期约为50 min，噬菌体侵染宿主菌EV76后60～140 min噬菌体产量急速增加，暴发期约80 min，随后进入平台期，裂解量约为7.1，见图 3。

图 3 鼠疫噬菌体YP060一步生长曲线

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5. 鼠疫噬菌体YP060宿主谱分析：在28 ℃和37 ℃时仅裂解鼠疫疫苗株EV76；对15株非鼠疫耶尔森菌均不裂解。这15株非鼠疫耶尔森菌包括假结核血清组Ⅰ～Ⅵ型；小肠结肠炎O：3标准株3株；小肠结肠炎O：9标准株2株；弗氏/中间耶尔森菌和克氏耶尔森菌各2株。

6. 理化因素敏感性试验结果：鼠疫噬菌体YP060在pH 5.0～10.0 范围内具有良好的裂解活性。当pH值为4和12时，噬菌体基本失去感染宿主的能力；热稳定性结果表明在50 ℃作用60 min后其活性基本保持不变，超过50 ℃其效价急剧下降；将氯仿与分离的鼠疫噬菌体YP060以1%、2%、5%的比例作用后，测定效价分别为2.26×10⁷、 1×10⁷、1×10⁷ PFU/ml，未经氯仿处理的鼠疫噬菌体YP060效价为2.3×10⁷ PFU/ml，提示该噬菌体的活性不受氯仿的影响；鼠疫噬菌体YP060经紫外线照射2～4 min后该噬菌体的存活率为17.5%，14 min后鼠疫噬菌体YP060失活，提示该噬菌体对紫外线比较敏感。

鼠疫是一种流行于啮齿动物间，通过跳蚤传播的自然疫源性疾病。在检验材料中检出鼠疫菌特异的噬菌体，则提示该材料中可能有鼠疫菌或不久前曾被鼠疫菌污染过^[2]。既往研究发现动物鼠疫流行末期及流行静息期，在自然界宿主动物体、媒介中常分离出非典型鼠疫菌和鼠疫噬菌体^[6]。细菌生存环境中，噬菌体扮演重要作用，如霍乱流行期间河口水体中噬菌体数量和霍乱弧菌数量存在一种此消彼长的关系^[16]。云南省玉龙县于2006年发现并证实为鼠疫自然疫源地以来^[17]，近10年动物鼠疫间歇流行^{[17, 18]}。本研究从该县黄山镇南溪村采集的鼠巢中分离到野生型鼠疫噬菌体，可能与近期的动物鼠疫流行相对应。

研究新发现的噬菌体的生物学特性，是认识该噬菌体的基本前提。本研究电镜观察显示鼠疫噬菌体YP060其形态符合肌尾噬菌体科特征。该噬菌体的最佳感染复数为0.1，由一步生长曲线得出噬菌体感染宿主菌潜伏期为50 min，暴发期为80 min，裂解量为7.1，符合烈性噬菌体生物学特征。本次分离的野生型噬菌体效价比较低，这可能与噬菌体裂解细菌细胞速度缓慢和生长环境、生长条件等有关。

鼠疫诊断标准目前基于“四步”检验，即培养、镜检、噬菌体裂解实验和动物实验。目前“四步”检验中，人们越来越依靠噬菌体裂解实验的结果来判定鼠疫菌，甚至一些地方仅剩下噬菌体实验。目前已经在鼠疫监测中发现天然的抗现有诊断鼠疫噬菌体的鼠疫菌存在。因此制备更多鼠疫诊断噬菌体的备选对鼠疫诊断具有重要意义。本研究发现的鼠疫噬菌体特异性较好。目前特异性评价的菌株样本数还较少，需要在更广泛菌株种属上进行系统评价。

噬菌体和细菌的相互作用中，噬菌体对维持细菌微生态和促进宿主菌进化具有非常重要意义。目前已经有5株鼠疫噬菌体的全基因组序列公布^[8]。通过对分离的噬菌体进行基因组测序，分析我国鼠疫噬菌体与国外噬菌体的系统进化关系，对研究鼠疫噬菌体种系发生具有重要意义。分离和鉴定更多的鼠疫自然疫源地鼠疫噬菌体将对我国鼠疫微生态研究具有重要意义。