高危型HPV16感染是宫颈癌的主要病因^[1]。但在感染者中，只有20%发展为非典型增生，而这些癌前病变中也只有1/5发展为宫颈癌^[2]，提示HPV感染并非宫颈癌发生的唯一因素。脆性组氨酸三联体（FHIT）横跨脆性位点FRA3B，该位点包含HPV16 DNA整合的部位，提示FHIT基因可能为HPV感染致癌提供了生物学基础，而HPV的整合也可能导致FHIT基因功能的缺失或失活^[3]。已有研究提示，宫颈癌中FHIT蛋白表达降低可能与FHIT基因甲基化有关^{[4, 5]}，且FHIT基因异常表达可能是HPV16作用的直接结果^[6]，但是FHIT基因甲基化和异常表达与HPV16感染在宫颈病变中的相互关系目前尚未阐明。为此本研究分析不同宫颈癌变患者中FHIT基因甲基化和蛋白表达水平，并探讨其与HPV16感染的交互效应，为宫颈癌变分子致癌机制研究提供依据。

1. 研究对象：选择2009年9月至2011年3月在山西省肿瘤医院、山西医科大学第二医院妇科、太原市妇幼保健院和介休市妇幼保健院就诊的新发宫颈鳞状细胞癌（SCC）100例，宫颈上皮内瘤样变（CIN）142例（72例CIN1，70例CIN2+）和正常宫颈（NC）妇女108例为研究对象。均为病理学确诊，未进行放疗、化疗等治疗，并排除其他肿瘤者。采用统一的结构式问卷，由培训合格的调查人员进行面对面调查。主要包括一般人口学特征、生活饮食习惯以及生殖情况。同时采集全部研究对象的手术或活检宫颈组织标本，于-80 ℃冰箱保存待检。研究通过山西医科大学伦理委员会审查并获得研究对象知情同意。

2. 研究方法：

（1）PCR检测宫颈组织HPV16 DNA：采用酚-氯仿法提取宫颈组织DNA，按照本研究前期报道的方法进行HPV16 DNA的扩增，确定高危型HPV16感染状态^[7]。

（2）甲基化特异性PCR（MSP）法检测FHIT基因甲基化状况：采用酚-氯仿抽提法提取宫颈组织的总DNA。参照本研究前期建立的方法检测FHIT基因甲基化状况^[8]。FHIT基因的甲基化引物：上游5′-TTG GGG CGC GGG TTT GGG TTT TTA CGC-3′，下游5′-CGT AAA CGA CGC CGA CCC CAC TA-3′；非甲基化引物：上游5′-TTG GGG TGT GGG TTT GGG TTT TTA TG-3′，下游：5′-CAT AAA CAA CAC CAA CCC CAC TA-3′。对PCR扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，在VILBER CV-A50C凝胶成像仪下观察，于74 bp处分别获得FHIT基因甲基化和未甲基化条带。

（3）Western Blot法检测FHIT蛋白的表达水平：取冻存宫颈组织50 mg，加适量WIP裂解液和PMSF的混合液，冰浴中匀浆，充分裂解。12 000 r/min离心，取上清，参照本研究前期建立方法检测FHIT蛋白表达水平^[9]。一抗为1：800 兔抗人FHIT单克隆抗体，在相对分子质量43 KD和16.8 KD处分别获得内参照蛋白β-actin和FHIT蛋白条带。利用Quantity One软件分析条带的吸光度值（A值），以目的条带与内参β-actin条带的A值之比作为FHIT蛋白的相对表达量。

3. 统计学分析：利用SPSS 20.0软件进行相关资料的t检验、方差分析、Kruskal-Wallis检验、 χ²检验，计算因素与宫颈癌变之间关联强度指标（OR值及其95%CI）。应用相加效应模型进行交互作用评价，并计算交互作用相对超额危险度（RERI）、交互作用归因比（AP）和交互作用指数（SI）进行交互作用的定量分析。以P＜0.05判断为差异有统计学意义。

1. 人口学特征及相关因素：NC、CIN1、CIN2+和SCC组年龄M值分别为47.81（30～69）、48.75（33～67）、45.62（34～75）和49.11（34～75）岁。各组间在民族、出生地、婚姻状况等方面的差异均无统计学意义（P＞0.05），而在年龄、职业、首次生育年龄、个人卫生习惯、文化程度、孕产次、人工流产史、妇科病史等方面的差异均有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表 1 研究对象人口学特征及相关因素

表选项

2. HPV16感染与宫颈癌变的关系：将HPV16 E6/E7 DNA任一阳性界定为HPV16阳性，对不同宫颈病变组HPV16感染状况分析。结果显示，HPV16感染率在CIN1（45.8%）、CIN2+（68.6%）和SCC（73.0%）组均高于NC组（28.7%），差异均有统计学意义，且随着宫颈病变的进展，HPV16感染率及OR值逐渐升高（趋势检验 χ²=47.623，P＜0.001），见表 2。

表 2 HPV16感染与宫颈癌变的关系

表选项

3. FHIT基因甲基化与宫颈癌变的关系：对不同宫颈病变组FHIT基因甲基化状态分析显示，FHIT基因甲基化率在CIN1（13.9%）、CIN2+（21.4%）和SCC（38.0%）组均高于NC组（3.7%），差异均有统计学意义，且随着宫颈病变程度加重，FHIT基因甲基化率及OR值呈升高趋势（趋势检验 χ²=40.147，P＜0.001），见表 3。

表 3 FHIT基因甲基化与宫颈癌变的关系

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4. FHIT蛋白表达与宫颈癌变的关系：FHIT蛋白表达在CIN1、CIN2+和SCC组均低于NC组，差异均有统计学意义。进一步以NC组FHIT蛋白表达量的50%点值（1.255）为界，将≤1.255作为低蛋白表达进行分析。结果显示，随着宫颈病变程度的加重，FHIT蛋白低表达率及OR值逐渐升高（趋势检验 χ²=65.098，P＜0.001），见表 4。

表 4 FHIT蛋白表达与宫颈癌变的关系

表选项

5. FHIT基因甲基化与FHIT蛋白表达在不同宫颈病变组中的变化趋势：随着宫颈病变程度的加重，FHIT基因甲基化率逐渐升高，而FHIT蛋白表达量逐渐降低（图 1）。

图 1 FHIT基因甲基化与FHIT蛋白表达在不同宫颈病变组中的变化趋势

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6. FHIT基因甲基化、蛋白表达与HPV16感染的交互效应：考虑到HPV16感染为宫颈癌的主要致病因素，进一步应用相加效应模型分析FHIT基因甲基化与HPV16感染，以及FHIT蛋白低表达与HPV16感染在不同宫颈病变组中的交互作用。结果显示，FHIT基因甲基化与HPV16感染以及FHIT蛋白低表达与HPV16感染在CIN1、CIN2+和SCC组中均显示有相加交互作用，当以上两因素同时存在时，发生宫颈癌及癌前病变的风险均高于单独某因素存在时的效应。定量分析显示，随着宫颈病变程度的加重，FHIT基因甲基化与HPV16感染以及FHIT蛋白低表达与HPV16感染之间交互效应指标RERI、AP以及SI值均逐渐升高（表 5）。

表 5 FHIT基因甲基化、FHIT蛋白表达与HPV16感染的交互效应

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宫颈癌的致病机制复杂，HPV感染，特别是高危型HPV持续感染与宫颈癌的发病密切相关，而HPV16是最常见的高危型亚型^[10]，全球超过一半的宫颈癌病例是由HPV16感染引起^[11]。本研究显示，HPV16在宫颈癌组中感染率为73%，且随宫颈病变程度加重，HPV16感染率逐渐升高。

研究发现，高危型HPV感染者只有15%～20%发生宫颈癌，提示在宫颈癌的发生中可能还存在HPV的协同因素或其他致癌因素。FHIT基因是近年新发现的抑癌基因，其异常表达与宫颈癌的发生发展密切相关，而FHIT基因甲基化是导致自身功能失活的重要机制之一^{[12, 13]}。目前DNA甲基化检测方法主要有MSP等^[14]。本研究采用MSP法检测不同宫颈病变组FHIT基因甲基化状态，结果显示FHIT基因甲基化与蛋白表达之间呈负相关关系，随着宫颈病变的进展，FHIT基因甲基化率逐渐升高，但蛋白表达水平逐渐降低。提示FHIT基因的高甲基化和蛋白低表达均可增加宫颈癌变的风险，FHIT基因甲基化可能是FHIT蛋白表达降低的重要机制之一，特别是FHIT蛋白这一代表基因功能状态的指标，在宫颈癌前病变的早期阶段即发生了下调，提示FHIT基因甲基化与FHIT蛋白的检测对宫颈癌变的早期发现具有重要的预警意义。

FHIT基因定位于染色体3p14.2，覆盖染色体脆性位点FRA3B及HPV16 DNA整合点，提示FHIT基因可为HPV16感染并致癌提供整合位点，FHIT基因异常表达与HPV16感染可能在宫颈癌的发生发展中起协同作用。本研究前期结果显示，FHIT基因甲基化及蛋白表达异常可增加宫颈癌和癌前病变的发生风险^[15]，但与HPV16之间的关系尚未阐明。基于此本次研究结果显示，FHIT基因甲基化与HPV16感染以及FHIT蛋白低表达与HPV16感染在宫颈癌及癌前病变中均存在相加交互效应，在以上两因素同时存在时，宫颈癌及癌前病变的发生风险均高于单独因素存在时的效应。定量分析结果显示，随着宫颈病变程度的加重，FHIT基因甲基化及蛋白低表达与HPV16感染之间交互效应指标（RERI、AP、SI）均逐渐升高，提示FHIT基因甲基化及蛋白低表达与HPV16感染在宫颈癌及癌前病变的发生发展中具有协同作用。在HPV16感染的同时，如果出现FHIT基因甲基化或者FHIT蛋白低表达，则宫颈病变加重的风险将大大增加。因此在育龄妇女中开展TCT筛查和HPV分型检查的同时，更应该检测FHIT基因甲基化与FHIT蛋白表达水平。由于DNA的甲基化是可逆的，特别是在癌变的早期，因此在积极预防和控制HPV16感染的同时，逆转FHIT基因的甲基化状态可能是治疗宫颈癌的有效途径。Giarnieri等^[16]研究也发现，在58例宫颈癌组织中HPV16感染与FHIT基因的表达呈负相关，显示FHIT基因表达异常与HPV16感染相互作用共同参与宫颈癌的发病。但也有学者认为，FHIT基因异常表达和HPV感染是参与宫颈癌发生的两个独立致病因素，HPV的整合和表达与FHIT基因表达异常无关^[17]。鉴于宫颈癌发病机制的复杂性，FHIT基因异常表达与HPV16感染在宫颈癌变中协同作用的具体机制还有待深入研究。