结核分枝杆菌持留菌的存在是导致肺结核复发和耐药的重要原因^[1]，其产生原因认为与毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin system，TAs）有关^{[2, 3]}。TAs由2个共表达的基因，即基因编码稳定的毒素蛋白（toxin）和基因编码不稳定的抗毒素蛋白（antitoxin）组成，二者通过蛋白与蛋白的相互作用形成复合体，抗毒素可中和毒素的作用，共同参与调控胞内基因表达及细胞程序性死亡等过程^[4]。目前已发现的结核分枝杆菌TAs由88对编码毒素-抗毒素蛋白的基因组成，包括RelBE、MazEF、ParDE、VapBC、HigAB等家族。新近研究表明，尽管大部分TAs的编码基因具有保守性，但仍有少量编码基因在某些菌株中呈现多态性^[5]。毒素-抗毒素伴侣（toxin-antitoxin- chaperone，TAC）隶属HigAB家族的一对由抗毒素HigA、毒素HigB及分子伴侣Rv1957三者共同组成的非典型TAs[编码抗毒素蛋白的基因higA（Rv1956）位于编码毒素蛋白基因higB（Rv1955）的下游，与典型TAs不同^[6]]。为此本研究分析TAC系统在结核分枝杆菌不同亚型菌株中的基因多态性，并探讨其生理意义。

1. 菌株来源：183株结核分枝杆菌临床分离株及标准菌株H37Rv均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病室传代、培养及保存。

2. DNA模板制备：采用水煮法提取结核分枝杆菌基因组DNA。刮取罗氏培养基上新鲜菌落50～100 mg，重悬于200 μl Tris-EDTA缓冲液，置于85 ℃30 min，然后100 ℃10 min，离心收集上清，贮存于-20 ℃备用。

3. Spoligotyping分型：PCR扩增DNA间隔区（引物为DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′，DRb：5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′）。扩增产物与固定的43对寡核苷酸探针杂交，其中37个间隔区序列来源于H37Rv标准株的DR区序列，其余来源于M. bovis BCG的DR区序列^[7]。

4. 药敏试验：采用比例法。培养基内4种一线药物终浓度分别为异烟肼（INH）0.2 μg/ml、利福平（RFP）40 μg/ml、链霉素（SM）4.0 μg/ml、乙胺丁醇（EMB）2.0 μg/ml。均购自美国Sigma公司。

5. TAC基因的PCR及测序：根据标准菌株H37Rv的基因序列（NC_000962.3）使用Primer 5.0软件设计引物，扩增引物序列见表 1。PCR体系总体积为25 μl，其中2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，无菌去离子水10.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，基因组DNA 1.0 μl。PCR反应条件为94 ℃预变性10 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增阳性对照孔以H37Rv基因组DNA为模板，阴性对照孔以无菌去离子水为模板。PCR产物由北京擎科新业生物技术有限公司测序后，使用Bioedit 7.05.3软件将测序结果与标准株H37Rv序列（GenBank序列号：NC_000962）进行比对。

表 1 PCR和测序引物

表选项

6. 非同义突变对蛋白结构和功能影响的预测分析：利用I-Mutant 2.0（http//folding.biofold.org/cgi-bin/i-mutant2.0.cgi）对突变位点进行蛋白功能影响的预测^[8]。

7. 统计学分析：采用SAS 9.2软件进行 χ²检验分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

1. 菌株分型：183株结核分枝杆菌临床分离株包括北京家族138株和非北京家族45株（包括T、H、U、CAS、MANU2、LAM和New，分别为19、6、3、3、3、2、9株），基本涵盖我国多数地区已发现的主要基因型。

2. TAC系统基因的多态性：对于编码TAC系统的3个基因，在183株菌中有149株菌发生突变，包括6种非同义突变和2种同义突变（表 2）。同义突变均发生在higA基因中，138株北京家族菌的121位点均由CAC突变为CAT，其中2株菌的95位点由CTG突变为TTG；在higA基因的149位点发生非同义突变，即GCA突变为TCA，导致编码的氨基酸由丙氨酸（Ala）突变为丝氨酸（Ser），此类突变仅发生在11株非北京家族菌中，其中1株菌同时携带111位点的非同义突变（CTC→CGC），氨基酸由亮氨酸（Leu）变为精氨酸（Arg）。对higB基因序列分析发现，有17株北京家族菌的30位点发生非同义变（GAC→GAG），致使编码的氨基酸由天冬氨酸（Asp）突变为谷氨酸（Glu），另有1株菌携带第1位点的突变（GTG→GGG）。Rv1957基因发生81（GCG→GTG）和147（GAC→GAG）位点的非同义突变，分别见于2株不同的北京家族菌株。

表 2 183株结核分枝杆菌临床分离株TAC操纵子基因突变情况

表选项

3. 突变基因与耐药相关性分析：经药敏试验，183株菌包括耐药菌132株（72.13%）和敏感菌51株（27.87%）。采用 χ²检验分析突变情况，耐药株中higA基因的多态性超过敏感株，其中耐INH株（χ²=2.57，P=0.11）、耐SM株（χ²=7.58，P=0.01）、耐RFP株（χ²=6.70，P=0.01）、耐EMB株（χ²=3.93，P=0.05），higB及Rv1957的多态性在2种菌株间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

4. 突变预测分析：在检测到的6个异义突变中，有4个突变对蛋白质结构的稳定性影响较大（DDG值＜0代表破坏蛋白质的稳定性，DDG值＞0代表增强蛋白质的稳定性），其中有3个仅发生在北京家族菌株中（表 3）。对同义突变的密码子使用频率进行分析，编码His的野生型密码子CAC使用频率为1.49，突变后的密码子CAT使用频率为0.51，编码Leu的野生型密码子CTG使用频率为3.44，突变后的密码子TTG使用频率为1.06。

表 3 结核分枝杆菌6个非同义突变的DDG预测值

表选项

结核分枝杆菌的TAC系统是由3个基因Rv1955、Rv1956和Rv1957共同编码，分别编码毒素蛋白HigB、抗毒素蛋白HigA和分子伴侣Rv1957。基因Rv1957编码一个类似大肠埃希菌中secB的伴侣蛋白，该分子伴侣协助HigA抗毒素蛋白的正确折叠^[9]，从而阻止抗毒素蛋白被ClpC1 等蛋白酶降解，这种相互作用有利于抗毒素蛋白HigA中和毒素蛋白HigB。当细菌遭遇环境压力（缺氧、饥饿等）时，毒素蛋白HigB被激活，通过切割RNA酶，最终导致细菌程序性死亡或进入生长抑制状态^[10]。在不利的生长压力下，细菌是死亡还是进入持留状态，可能取决于TAs的类型及毒素蛋白暴露的时间。有学者认为TAs可作为治疗结核病的新药物靶点，即通过抑制抗毒素的表达，使大量的毒素蛋白聚集，从而杀死细胞^[11]。

对于同义密码子，不同生物的使用频率有很大差异，并影响其转化效率^[12]，目前已知晓结核分枝杆菌优先使用不同的氨基酸密码子。在138株北京型菌株中，存在两种不同类型的同义碱基替换，因此，本研究分析了TAC系统中同义替换的氨基酸密码子的使用情况。编码组氨酸（His）的野生型密码子使用频率为1.49，突变后的密码子CAT使用频率降为0.51；编码亮氨酸（Leu）的野生型密码子使用频率为3.44，突变后的密码子TTG使用频率降为1.06，这些偏爱密码子的改变可能会影响蛋白的表达。

183株菌有149株（81.42%）发生突变，其中有138株（92.62%）属于北京家族。本研究发现TAC系统中的突变，特别是异义核苷酸的改变，均造成相应氨基酸的改变，进而可能影响蛋白产物的表达。有31株菌发生异义核苷酸改变，占所有菌株的16.94%，其中64.52%（20/31）的菌株属于北京家族。在6个异义突变中，预测有4个对蛋白的影响较大，有3个仅发生在北京家族菌株中。研究中发现北京家族菌株的TAC系统与非北京家族相比，具有更高的基因多态性。已有研究表明北京家族菌株作为优势菌株，更易传播，易致病，易耐药^{[13, 14]}。北京基因型菌株在Rv3908、mutT2和ogt三种公认的DNA突变修复基因上表现出独特的错义突变，这些突变可导致细菌突变频率增加，部分地解释了北京家族菌株快速适应环境的能力^[15]。TAC系统作为一个毒力基因，在本研究中发现北京家族呈现更高的多态性水平，这可能更有利于结核分枝杆菌北京家族菌株适应不同的宿主环境。此外higA（Rv1956）基因序列比对发现，所有的北京家族菌株在第121位的组氨酸（His）存在特异性的CAC121CAT突变，这个特异性的SNP位点可以被用来鉴别北京型家族和非北京家族菌株。

TAs参与细菌的持留，而持留菌的特征之一即对药物不敏感。本文对TAC系统基因与耐药表型之间的关系进行了探索，在组成TAC系统的3个基因中，仅编码抗毒素蛋白HigA的基因多态性可能与耐药表型相关。位于higA基因的CAC121CAT突变位点在耐SM和耐RFP菌株中的突变频率高于敏感株，且差异有统计学意义（P＜0.05）。结核分枝杆菌耐SM和RFP可能与higA（Rv1956）基因突变有关，且CAC121CAT突变位点是北京基因型的特异性突变位点，由此推论北京基因型菌株可能更易耐药。

综上所述，结核分枝杆菌TAC系统的基因多态性的研究为全面了解结核分枝杆菌的致病性、基因结构与功能及其分子演化奠定基础。