已有研究显示，HBV感染后的转归与患者种族、免疫状态和遗传因素有关^[1]。Ganem和Prince^[2]提出某些与机体免疫应答密切相关的基因单核苷酸多态性（SNP）影响HBV感染后的结局。人类白细胞抗原（HLA）复合体是目前所知人类最为复杂的调控机体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的基因系统。2009年日本学者Kamatani等^[3]首次报道了在亚洲地区人群中，位于HLA-DPAl区的rs3077和HLA-DPAl区的rs92775352与慢性乙型肝炎（乙肝）密切相关。然后相继有学者在日本、韩国人群中证实了这一结果^{[4, 5, 6]}。在中国不少学者对汉族人群的相关研究也证实了这一结论^{[7, 8, 9]}。但在少数民族人群中相关研究则少见报道。本研究选取贵州省少数民族地区作为采样点，探讨位于HLA-DP基因上的2个SNP位点（rs3077和rs9277535）与HBV感染的关系。

1. 研究对象：2013年9－12月对贵州省雷山县和荔波县1 654例世居少数民族（以布依族、苗族、水族为主）人群进行乙肝相关筛查。根据《乙型肝炎诊断标准（WS 299-2008）》结合乙肝血清学检测指标、肝生化指标及乙肝血清中HBV DNA定量结果选择533例作为研究对象：①HBV感染组：HBsAg阳性（126例）和HBsAg阴性但血清学HBV核酸（HBV DNA）定量＞10³ IU/ml的个体（130例）共256例；②HBV自限性感染者：抗-HBs（+）或抗-HBc（+）或抗-HBs、抗-HBc、抗-HBe中至少2种阳性且HBsAg、HBeAg和HBV DNA均为阴性的个体共142例；③健康对照组：135例。各组样本的具体肝功能指标、HBV血清学标志物检测指标、HBV DNA定量结果等见表 1。本研究通过贵阳医科大学附属医院伦理委员会审查，所有受试者均签署知情同意书。

表 1 样本人群感染HBV情况及临床生化指标在各组之间的比较

表选项

研究对象的民族分布：布依族280例，其中HBV感染组139例，HBV自限性感染组70例，健康对照组71例；苗族169例，其中HBV感染组71例，HBV自限性感染组60例，健康对照组38例；水族67例，其中HBV感染组42例，HBV自限性感染组7例，健康对照组18例；侗族15例，其中HBV感染组3例，HBV自限性感染组5例，健康对照组7例；瑶族2例，其中HBV感染组和健康对照组各1例（由于研究对象中侗族和瑶族个体较少，故结果中分民族比较时未对这两个民族进行比较）。

2. 基因分型：

（1）白细胞DNA的提取：抽取受检者肘静脉血3 ml，采用德国Qiagen公司的FlexiGenen全血基因组DNA提取试剂盒提取外周血DNA、DU640蛋白质核酸定量分析仪（美国Beckman公司）检测DNA浓度和纯度，DNA终浓度稀释至30 ng/μl，于-20 ℃冰箱保存备用。

（2）TaqMan MGB实时荧光定量PCR技术对HLA-DP基因的rs3077和rs9277535位点进行分型：PCR反应体系（10 μl）：DNA溶液（浓度30 ng/μl）1.5 μl，2×TaqMan Universal Master Mix 5.0 μl，20×Assay Working Stock 0.25 μl加ddH₂O补足10 μl。其中2×TaqMan Universal Master Mix、20×Assay Working Stock均购自美国ABI公司，探针分别用FAM、VIC染料标记。PCR反应条件：60 ℃ 30 s，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，55个循环；60 ℃ 30 s。仪器采用美国ABI公司的StepOne plus 实时荧光定量PCR仪。所有样本在完成检测后随机抽取5%样本进行重测，一致性为100%。

（3）测序验证：根据基因分型结果，每种基因型随机抽取5个样本送美国Thermo Fisher Scientific公司测序验证。rs3077位点测序上游引物：5′-CTTGGCTCCTATGTGCTC-3′，下游引物：5′-TCGTGTTAGGGTATTCTCG-3′。rs9277535位点测序上游引物：5′-CTGAGGGTTTTAGTAGAC AGTAGG-3′，下游引物：5′-GCATTCAAAAGT CCAAGCCGTA-3′。

3. 统计学分析： χ²检验分析2个SNP位点基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg（H-W）遗传平衡。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间差异采用单因素方差分析。计数资料如基因型和等位基因型分布差异等用 χ²检验。采用二分类logistic回归分析计算经年龄和性别校正的OR值及其95%CI，P＜0.05为差异有统计学意义。

1. 一般情况：HBV感染组与HBV自限性感染组及健康对照组之间比较，平均年龄差异无统计学意义。HBV感染组血清AST、ALT均高于HBV自限性感染组及健康对照组，且与HBV自限性感染组之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。而HBV自限性感染组与健康对照组比较，AST、ALT差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

2. H-W遗传平衡检验及测序：利用 χ²检验对135例健康对照者和142例HBV自限性感染者HLA-DP基因上的rs3077、rs9277535位点多态性进行H-W遗传平衡检验，结果均符合H-W遗传平衡（P＞0.05）。rs3077和rs9277535位点每种基因型各随机抽取5个样本经过测序，结果显示，TaqMan- MGB法基因分型结果与测序结果完全相符。

3. 各组rs9277535、rs3077位点的等位基因及基因型分布：HBV感染组、HBV自限性感染组和健康对照组等位基因和基因型分布：rs9277535位点的A、G等位基因在健康对照组和HBV感染组间分布差异有统计学意义（P＜0.05），AA、AG、GG基因型频率在各组间的分布差异无统计学意义（P＞0.05）；rs3077位点的CC、CT、TT及C、T等位基因频率在组间的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。显性模型下各组之间比较基因型分布：健康对照组rs9277535位点AA+AG基因型频率高于HBV感染组，差异有统计学意义（P＜0.05），校正性别、年龄因素后显示，携带rs9277535位点基因型与HBV感染存在相关性（AA+AG vs. GG，OR=0.645，95%CI：0.421～0.988），rs3077位点与HBV感染无明显相关性，见表 2。性别分层后在显性模型下，男性健康对照组rs3077位点CC+CT基因型频率高于HBV感染组和HBV自限性感染组，与HBV感染组比较差异有统计学意义（P＜0.05），进一步的二元logistic回归分析显示，rs3077基因型与HBV患病风险相关（CC+CT vs. TT，OR=0.493，95%CI：0.266～0.916）；rs9277535位点性别分层后各组显性模型下比较差异无统计学意义，见表 3。

表 2 HBV感染组、HBV自限性感染组、健康对照组rs9277535和rs3077位点的等位基因及基因型分布

表选项

表 3 性别分层后HBV感染组、HBV自限性感染组、健康对照组rs9277535和rs3077位点多态性

表选项

4. 各民族rs9277535位点和rs3077位点基因型频率及等位基因频率分布情况：rs9277535位点的等位基因及基因型频率在布依族、苗族、水族人群中HBV感染组、HBV自限性感染组、健康对照组之间的分布差异无统计学意义（P＞0.05），见表 4；rs3077位点等位基因及基因型频率分布在布依族、苗族、水族人群中不同组别之间的比较显示，布依族人群rs3077位点的基因型在HBV感染组与健康对照组中的分布差异有统计学意义（χ² =6.726，P=0.036），其余各人群不同组别之间比较rs3077位点等位基因及基因型频率分布差异均无统计学意义（P＞0.05），见表 5。

表 4 布依族、苗族、水族人群rs9277535位点的等位基因及基因型频率分布

表选项

表 5 布依族、苗族、水族人群rs3077位点的等位基因及基因型频率分布

表选项

Kamatani等^[3]首次发现HLA-DP上的2个SNP位点（rs3077和rs9277535）与亚洲地区人群慢性HBV感染存在相关性，并进一步指出携带rs3077C和rs9277535A可能为HBV感染的保护性因素。Vermehren等^[10]对高加索人群的研究显示，HLA-DP上的rs9277535位点与HBV的持续性感染并无相关性。苏明宽等^[11]针对中国福建省汉族人群的研究显示，HLA-DP基因的rs3077、rs9277535位点与HBV感染和清除存在一定的相关性。本研究显示，贵州省少数民族HLA-DP基因的rs3077、rs9277535位点多态性在HBV感染组、HBV自限性感染组和健康对照组之间的差异无统计学意义。显性模型下校正年龄、性别因素后显示，rs9277535位点AA+AG基因型与GG基因型相比为乙肝易感的保护因素；进一步性别分层后的显性模型下，男性携带rs3077C等位基因相对于TT基因型而言是使机体免受HBV感染的保护因素，与Kamatani等^[3]、Yan等^[7]的研究结果一致；而rs9277535位点的基因型分布则在性别分层后各组之间的差异无统计学意义，与已有研究结果不一致^{[3, 7, 12]}，提示在贵州少数民族群体中rs9277535位点的基因型分布可能与性别无明显的相关性。里进^[13]的研究指出，以HBV自然清除组作为对照，与HBV感染组相比，HLA-DP的rs9277535 位点在中国南方汉族人群中与病毒清除相关（OR=1.33，95%CI：1.20～1.49，P=1.67×10^-7）。而本研究中HBV感染组与HBV自限性感染组之间rs3077、rs9277535位点的基因型分布差异无统计学意义，其原因可能是地域及民族差异或样本量太小。

本课题组的前期研究显示，某些参与HBV免疫调节的基因如IL-10^[14]、趋化因子RANTES基因^[15]等在不同民族之间分布存在差异。本研究对入选研究对象进行民族分群后比较各组之间基因型及等位基因的分布，结果显示，布依族人群中rs3077位点的基因型分布在HBV感染组与健康对照组之间差异有统计学意义（P＜0.05），提示rs3077位点多态性与HBV感染之间的相关性在布依族人群较明显，而在苗族、水族人群中未见明显相关性。

总之，本研究结果显示个体携带HLA-DP rs9277535非-GG基因型、男性携带HLA-DP rs3077位点非-TT基因型可能是使机体免受HBV感染的一个保护因素，且不同民族rs3077位点基因型分布存在一定差异。但探寻HLA基因与乙肝感染之间的关系需结合该基因上的众多标签位点的研究并以此构建单倍型，在尽量大的样本量基础上进行联合分析才能找到HLA基因与乙肝感染之间存在一定关联的相关机制，从而为乙肝的早期预防及治疗提供可靠的理论依据。