文章信息
- 王艳华, 彭遥, 夏连续. 2015.
- Wang Yanhua, Peng Yao, Xia Lianxu. 2015.
- 中国土拉弗朗西斯菌holarctica亚种的遗传多样性
- Genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in China
- 中华流行病学杂志, 2015, 36(12): 1410-1414
- Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(12): 1410-1414
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.12.021
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文章历史
- 收稿日期: 2015-07-02
土拉弗朗西斯菌(土拉菌)是一种具有较强传染性的、能够引起土拉热的胞内寄生菌。土拉热主要由2个亚种引起:subsp. tularensis(A型)和subsp. holarctica(B型)。A型分布仅限于北美地区。B型亚种的研究主要集中在欧洲地区,根据地理分布特征,欧洲地区的土拉菌分为两个亚群[1]。在西班牙、法国和瑞士等国几乎分离的土拉菌都属于B.Br.FTNF002-00亚群[2, 3, 4, 5],而从捷克、俄罗斯等国分离的大多数土拉菌属于B.Br.013亚群内的多个谱系[2, 4, 6]。目前,B型各亚群在亚洲地区的分布不是很清楚,关于中国土拉菌B型亚种和欧美地区B型亚种之间关系的研究更是少见。为了解中国土拉菌和国外土拉菌在亚型上的异同点,从而能够在土拉热暴发和流行时进行菌株溯源。前期以单核苷酸多态性(SNP)为基础,初步进行了中国土拉菌的遗传进化关系研究[7]。本研究拟通过针对土拉菌B型亚种建立一套简易高效的分型方法,进行更加深入地探讨。
材料与方法1. 土拉菌来源:本研究的10株中国土拉菌中,410105、 410108、410109、410111、410112、410113和920607来源于西藏,410116和410117来源于新疆,410107来源于黑龙江。另外,还有29个参考菌株,包括SCHU S4、FSC147、FTNF002-00、U112、WY96-3418、OSU18、LVS、FSC198、FSC033、MA00-2987、NE061598、257、FSC022、FSC200、GA99-3548、GA99-3549、RC503、MI001730、OR96246、F92、URFT1、ATCC6223、80700103、AS_713、831、70102010、TIGB03、TI0902和80700075,基因组信息获取网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/511或http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/francisella_tularensis_group/Regions.html。
2. 选择适合的SNP和插入/缺失(INDEL):根据前期研究[7],从fopA和tul4基因中选出6个SNP位点(F1、F2、F3、F4、F5和F6)。从以往用于B型亚种分型的遗传标记中[2, 4],选择更有效力的11个SNP位点(B2、B3、B4、B5、B6、B12、B16、B17、B19、B20和B23)和4个INDEL位点(Ftind33、Ftind38、Ftind48和Ftind49),共21个遗传标记作为本研究的靶位点(表1)。为了获得准确的SNP信息,对于中国土拉菌,所有的SNP位点都通过测序获得,F1~F6位点SNP状况从以前的测序结果中得到[7]。每个INDEL位点均通过2对引物(CP-IN和CP-OUT)扩增以确定是否有插入片段的存在。CP-OUT引物作为阳性对照。对于29个测序菌株,在基因组序列中通过比对上下游引物,可以找到相应位置的SNP位点以及确定检测片段的插入和缺失。
3. 选择适合的VNTR:不考虑A型亚种,仅考虑对于B型亚种分型能力较强,同时考虑时间和费用的最佳组合。从25个VNTR位点中,选出对于B型亚种分型能力较强的12个位点(Ft-M3、Ft-M4、Ft-M6、Ft-M8、Ft-M10、Ft-M13、Ft-M16、Ft-M18、Ft-M20、Ft-M21、Ft-M22和Ft-M24),引物序列和退火温度参照文献[8]。通过PCR方法在10株中国土拉菌中12个VNTR位点重复扩增3次。在每个VNTR位点,保证每种片段长度的PCR产物都要通过测序来获得碱基序列,再查找重复基元的拷贝数。对于29个参考菌株,在基因组序列中通过比对上下游引物找到12个VNTR区域,再查找重复基元的拷贝数。
4. 系统进化分析:采用PAUP 4.0b10软件建立系统进化树,采用最大似然法(MP)构建,MP分析采用50次替换。引导分析用1 000次替换的启发式研究,节点值小于50被剔除。
结 果1. SNP-INDEL分析:21个SNP和INDEL在39株土拉菌中的分布情况见图1。
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图 1 21个SNP和INDEL在39株土拉菌中的分布 注:对于SNP,菌株状况和SCHU S4一致的,用○表示,反之则用●表示; 对于INDEL,缺失用○表示,插入则用●表示 |
SNP-INDEL分析能够很好地将4个亚种区分出来,而且,不仅能够将A型的两个主要分支A1和A2区分开,对于B型也能够将日本土拉菌和北半球其他国家的土拉菌区分开(图2A)。从主干到分支的进化分析为:F1可以将subsp. novicida区分开;F2和F6可以将subsp. tularensis区分开;F3可以将subsp. holarctica区分开。在subsp. tularensis内,F4可以将A2区分出来,F5可以进一步将毒力弱的ATCC6223和其他A2菌株区分出来。引导分析的节点值大于50的,在节点左上方标出(图2),在节点的左下方标出了分型标记(图2A)。
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图 2 采用SNP-INDEL、MLVA单独和组合方法分析土拉菌之间的遗传进化关系 |
2. MLVA分析:MLVA不能将subsp. novicida和subsp. mediasiatica区分开,能够将A型中的A1和A2以及B型中的日本来源菌株和其他来源菌株区分开(图2B)。在树状图主干进化支上,SNP-INDEL的节点值较高(图2A),而MLVA的节点值均低于50(图2B)。
3. 组合分析:SNP-INDEL和MLVA组合分析显示,与SNP-INDEL、MLVA单独分析相比,在远端分支上的节点值增加(图2C),这说明对于菌株间的区分能力增强。组合分析方法将subsp. holarctica分为5个亚型,分别命名为B1~B5。值得注意的是,中国的10株土拉菌分到了4个亚型中,3株和瑞典的FSC200分到B1;3株和美国的OSU18分到B2;1株和法国的FTNF002-00、德国的F92、美国的OR96246分到B4;最后3株和日本的FSC022分到B5。
讨 论细菌的分子分型和系统进化分析的方法很多,目前一致认为,SNP是缓慢突变的标记,在分支的主干上能够保证系统进化分类的正确性;而MLVA是非常快速突变的标记,在远端的分支上对各亚种内的菌株个体能够进行细致的区分。如果将SNP和MLVA组合,能够互补不足、发挥各自的优势,达到更加理想的分析效果。另外,INDEL能够增加SNP在主要进化节点上的支持度和结果的可靠性,并增强节点上的分辨力[4, 9]。因此,将SNP-INDEL和MLVA组合起来,在主干进化支上SNP-INDEL保证分类的正确性和可靠性,在远端进化支上MLVA对菌株个体进行细致的区分,二者组合就会对土拉菌的进化分析提供更高的精确性和分辨力[10]。为了最小化遗传标记的数量,根据前期的工作[7]和以往的研究结果[2, 4],选出17个SNP和4个INDEL建立了一个分型系统。SNP-INDEL和MLVA单独分析构建的树状图,虽然在分类上略有不同,但是对于所有B型菌株均分为日本土拉菌和非日本土拉菌,在这两个亚组的主要分界点上是一致的。本研究显示:SNP-INDEL和MLVA组合分析,既在主干系统进化关系上获得了更高的精确性,同时对于亚种内的菌株个体之间又表现出更强的分辨力。因此,本研究针对土拉菌B型亚种建立了一套简易高效的分型方法。
在本研究的SNP-INDEL分析中,测序菌株SCHU S4、FSC033和WY96-3418、ATCC6223分别被分到A1和A2亚群中,分类结果与Svensson等[4]一致。与SNP-INDEL相比,MLVA明显地表现出较高的多态性,对描述菌株个体的特征很有帮助。组合分析方法将subsp. holarctica分为5个亚型(B1~B5),和Svensson等[4]的分析结果一致。中国10株土拉菌被分配到4个亚型中,表现出多样性的遗传特征。虽然设计时选择的遗传标记未考虑subsp. tularensis,但SNP-INDEL和MLVA组合分析同样也能将subsp. tularensis区分为两个主要亚群,只是未能将subsp. novicida和subsp. mediasiatica区分开。
一项日本研究显示:日本33株菌中有31株被分配到在ClusterⅠ,仅有2株和其他国家来源的菌株被分配在ClusterⅡ,表明日本菌株具有显著的本国特有的遗传特征[11]。值得注意的是,在SNP- INDEL和MLVA的单独、以及二者的组合分析中,中国土拉菌410108、410109、410111和日本的FSC022均被分配到一个分支,这说明中国土拉菌和日本土拉菌具有某些相同的遗传特征。由图1可看到,3株中国土拉菌在B2、B3的SNP状况与FSC022完全相同,而和其他的subsp. holarctica的SNP状况都不相同。另外,在B16中国这3株土拉菌的SNP状况仍然与FSC022完全相同,而其他包括4个亚种的35株土拉菌的SNP状况都和这4株菌的不同。按照Svensson等[4]的推论,中国这3株土拉菌可以和日本土拉菌一同归入B5亚型。除本研究发现的中国菌株,到目前为止,其他采用SNP/MLVA分析方法,日本来源的菌株都是单独被分到一个亚组[2, 8, 9, 12],没有任何其他国家的菌株能和日本来源的菌株分到一起的。在SNP-INDEL和MLVA的组合分析中,除了B3是俄罗斯菌株独有的亚型外,其余4个亚型(B1、B2、B4和B5)都包含有中国土拉菌,再次证实中国土拉菌的遗传多样性[13]。
目前研究认为,土拉菌subsp. holarctica之间的遗传差异性很小,说明这个亚种仅仅是最近克服了一个遗传学障碍才得以出现,然后迅速地播散到整个北半球[8, 9, 14, 15, 16, 17]。然而,对于subsp. holarctica的起源问题一直有争议。Vogler等[2]持两种观点,一种是根据FSC022在进化支中的基础位置,认为这个亚种可能起源于亚洲地区;另外,根据MIP SNP分析中加利福尼亚谱系也在较基础的位置,认为这个亚种也可能起源于北美,然后通过B辐射播散到现在分布的地区。遗憾的是,系统进化分析中的土拉菌数据仅包括了日本菌株,而没有亚洲地区其他来源的菌株。这些假设是建立在一个中心多样性的理论基础之上的,它的含义是如果一个地区能够观察到最多的遗传多样性,那么这个地区可能就是实验组的起源地,实验组在这里分化、然后再进一步从这里向外播散[2]。本研究显示,中国3株土拉菌和日本FSC022一同位于B型系统进化结构中的基础位置,同时也表现出高水平的遗传多样性。那么是否可以认为,亚洲地区可能是subsp. holarctica的起源地?从1株全基因组测序的格鲁吉亚土拉菌中筛选出几个SNP,然后将这几个SNP放在全球系统进化分析的标记中,结果发现格鲁吉亚谱系被分配到B.Br.013内B.Br.026分支的基础位置,于是认为格鲁吉亚可能是B.Br.013更老的起源地[6]。同理,将中国本土的土拉菌测序后补充新的SNP,放在subsp. holarctica的全球遗传进化背景下分析,可能会得出一些更接近于事实真相的结论。
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