土拉弗朗西斯菌（土拉菌）是一种具有较强传染性的、能够引起土拉热的胞内寄生菌。土拉热主要由2个亚种引起：subsp. tularensis（A型）和subsp. holarctica（B型）。A型分布仅限于北美地区。B型亚种的研究主要集中在欧洲地区，根据地理分布特征，欧洲地区的土拉菌分为两个亚群^[1]。在西班牙、法国和瑞士等国几乎分离的土拉菌都属于B.Br.FTNF002-00亚群^{[2, 3, 4, 5]}，而从捷克、俄罗斯等国分离的大多数土拉菌属于B.Br.013亚群内的多个谱系^{[2, 4, 6]}。目前，B型各亚群在亚洲地区的分布不是很清楚，关于中国土拉菌B型亚种和欧美地区B型亚种之间关系的研究更是少见。为了解中国土拉菌和国外土拉菌在亚型上的异同点，从而能够在土拉热暴发和流行时进行菌株溯源。前期以单核苷酸多态性（SNP）为基础，初步进行了中国土拉菌的遗传进化关系研究^[7]。本研究拟通过针对土拉菌B型亚种建立一套简易高效的分型方法，进行更加深入地探讨。

1. 土拉菌来源：本研究的10株中国土拉菌中，410105、 410108、410109、410111、410112、410113和920607来源于西藏，410116和410117来源于新疆，410107来源于黑龙江。另外，还有29个参考菌株，包括SCHU S4、FSC147、FTNF002-00、U112、WY96-3418、OSU18、LVS、FSC198、FSC033、MA00-2987、NE061598、257、FSC022、FSC200、GA99-3548、GA99-3549、RC503、MI001730、OR96246、F92、URFT1、ATCC6223、80700103、AS_713、831、70102010、TIGB03、TI0902和80700075，基因组信息获取网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/511或http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/francisella_tularensis_group/Regions.html。

2. 选择适合的SNP和插入/缺失（INDEL）：根据前期研究^[7]，从fopA和tul4基因中选出6个SNP位点（F1、F2、F3、F4、F5和F6）。从以往用于B型亚种分型的遗传标记中^{[2, 4]}，选择更有效力的11个SNP位点（B2、B3、B4、B5、B6、B12、B16、B17、B19、B20和B23）和4个INDEL位点（Ftind33、Ftind38、Ftind48和Ftind49），共21个遗传标记作为本研究的靶位点（表1）。为了获得准确的SNP信息，对于中国土拉菌，所有的SNP位点都通过测序获得，F1～F6位点SNP状况从以前的测序结果中得到^[7]。每个INDEL位点均通过2对引物（CP-IN和CP-OUT）扩增以确定是否有插入片段的存在。CP-OUT引物作为阳性对照。对于29个测序菌株，在基因组序列中通过比对上下游引物，可以找到相应位置的SNP位点以及确定检测片段的插入和缺失。

表 1 21个SNP和INDEL标记和引物

表选项

3. 选择适合的VNTR：不考虑A型亚种，仅考虑对于B型亚种分型能力较强，同时考虑时间和费用的最佳组合。从25个VNTR位点中，选出对于B型亚种分型能力较强的12个位点（Ft-M3、Ft-M4、Ft-M6、Ft-M8、Ft-M10、Ft-M13、Ft-M16、Ft-M18、Ft-M20、Ft-M21、Ft-M22和Ft-M24），引物序列和退火温度参照文献[8]。通过PCR方法在10株中国土拉菌中12个VNTR位点重复扩增3次。在每个VNTR位点，保证每种片段长度的PCR产物都要通过测序来获得碱基序列，再查找重复基元的拷贝数。对于29个参考菌株，在基因组序列中通过比对上下游引物找到12个VNTR区域，再查找重复基元的拷贝数。

4. 系统进化分析：采用PAUP 4.0b10软件建立系统进化树，采用最大似然法（MP）构建，MP分析采用50次替换。引导分析用1 000次替换的启发式研究，节点值小于50被剔除。

1. SNP-INDEL分析：21个SNP和INDEL在39株土拉菌中的分布情况见图1。

图 1 21个SNP和INDEL在39株土拉菌中的分布 注：对于SNP，菌株状况和SCHU S4一致的，用○表示，反之则用●表示； 对于INDEL，缺失用○表示，插入则用●表示

图选项

SNP-INDEL分析能够很好地将4个亚种区分出来，而且，不仅能够将A型的两个主要分支A1和A2区分开，对于B型也能够将日本土拉菌和北半球其他国家的土拉菌区分开（图2A）。从主干到分支的进化分析为：F1可以将subsp. novicida区分开；F2和F6可以将subsp. tularensis区分开；F3可以将subsp. holarctica区分开。在subsp. tularensis内，F4可以将A2区分出来，F5可以进一步将毒力弱的ATCC6223和其他A2菌株区分出来。引导分析的节点值大于50的，在节点左上方标出（图2），在节点的左下方标出了分型标记（图2A）。

图 2 采用SNP-INDEL、MLVA单独和组合方法分析土拉菌之间的遗传进化关系

图选项

2. MLVA分析：MLVA不能将subsp. novicida和subsp. mediasiatica区分开，能够将A型中的A1和A2以及B型中的日本来源菌株和其他来源菌株区分开（图2B）。在树状图主干进化支上，SNP-INDEL的节点值较高（图2A），而MLVA的节点值均低于50（图2B）。

3. 组合分析：SNP-INDEL和MLVA组合分析显示，与SNP-INDEL、MLVA单独分析相比，在远端分支上的节点值增加（图2C），这说明对于菌株间的区分能力增强。组合分析方法将subsp. holarctica分为5个亚型，分别命名为B1～B5。值得注意的是，中国的10株土拉菌分到了4个亚型中，3株和瑞典的FSC200分到B1；3株和美国的OSU18分到B2；1株和法国的FTNF002-00、德国的F92、美国的OR96246分到B4；最后3株和日本的FSC022分到B5。

细菌的分子分型和系统进化分析的方法很多，目前一致认为，SNP是缓慢突变的标记，在分支的主干上能够保证系统进化分类的正确性；而MLVA是非常快速突变的标记，在远端的分支上对各亚种内的菌株个体能够进行细致的区分。如果将SNP和MLVA组合，能够互补不足、发挥各自的优势，达到更加理想的分析效果。另外，INDEL能够增加SNP在主要进化节点上的支持度和结果的可靠性，并增强节点上的分辨力^{[4, 9]}。因此，将SNP-INDEL和MLVA组合起来，在主干进化支上SNP-INDEL保证分类的正确性和可靠性，在远端进化支上MLVA对菌株个体进行细致的区分，二者组合就会对土拉菌的进化分析提供更高的精确性和分辨力^[10]。为了最小化遗传标记的数量，根据前期的工作^[7]和以往的研究结果^{[2, 4]}，选出17个SNP和4个INDEL建立了一个分型系统。SNP-INDEL和MLVA单独分析构建的树状图，虽然在分类上略有不同，但是对于所有B型菌株均分为日本土拉菌和非日本土拉菌，在这两个亚组的主要分界点上是一致的。本研究显示：SNP-INDEL和MLVA组合分析，既在主干系统进化关系上获得了更高的精确性，同时对于亚种内的菌株个体之间又表现出更强的分辨力。因此，本研究针对土拉菌B型亚种建立了一套简易高效的分型方法。

在本研究的SNP-INDEL分析中，测序菌株SCHU S4、FSC033和WY96-3418、ATCC6223分别被分到A1和A2亚群中，分类结果与Svensson等^[4]一致。与SNP-INDEL相比，MLVA明显地表现出较高的多态性，对描述菌株个体的特征很有帮助。组合分析方法将subsp. holarctica分为5个亚型（B1～B5），和Svensson等^[4]的分析结果一致。中国10株土拉菌被分配到4个亚型中，表现出多样性的遗传特征。虽然设计时选择的遗传标记未考虑subsp. tularensis，但SNP-INDEL和MLVA组合分析同样也能将subsp. tularensis区分为两个主要亚群，只是未能将subsp. novicida和subsp. mediasiatica区分开。

一项日本研究显示：日本33株菌中有31株被分配到在ClusterⅠ，仅有2株和其他国家来源的菌株被分配在ClusterⅡ，表明日本菌株具有显著的本国特有的遗传特征^[11]。值得注意的是，在SNP- INDEL和MLVA的单独、以及二者的组合分析中，中国土拉菌410108、410109、410111和日本的FSC022均被分配到一个分支，这说明中国土拉菌和日本土拉菌具有某些相同的遗传特征。由图1可看到，3株中国土拉菌在B2、B3的SNP状况与FSC022完全相同，而和其他的subsp. holarctica的SNP状况都不相同。另外，在B16中国这3株土拉菌的SNP状况仍然与FSC022完全相同，而其他包括4个亚种的35株土拉菌的SNP状况都和这4株菌的不同。按照Svensson等^[4]的推论，中国这3株土拉菌可以和日本土拉菌一同归入B5亚型。除本研究发现的中国菌株，到目前为止，其他采用SNP/MLVA分析方法，日本来源的菌株都是单独被分到一个亚组^{[2, 8, 9, 12]}，没有任何其他国家的菌株能和日本来源的菌株分到一起的。在SNP-INDEL和MLVA的组合分析中，除了B3是俄罗斯菌株独有的亚型外，其余4个亚型（B1、B2、B4和B5）都包含有中国土拉菌，再次证实中国土拉菌的遗传多样性^[13]。

目前研究认为，土拉菌subsp. holarctica之间的遗传差异性很小，说明这个亚种仅仅是最近克服了一个遗传学障碍才得以出现，然后迅速地播散到整个北半球^{[8, 9, 14, 15, 16, 17]}。然而，对于subsp. holarctica的起源问题一直有争议。Vogler等^[2]持两种观点，一种是根据FSC022在进化支中的基础位置，认为这个亚种可能起源于亚洲地区；另外，根据MIP SNP分析中加利福尼亚谱系也在较基础的位置，认为这个亚种也可能起源于北美，然后通过B辐射播散到现在分布的地区。遗憾的是，系统进化分析中的土拉菌数据仅包括了日本菌株，而没有亚洲地区其他来源的菌株。这些假设是建立在一个中心多样性的理论基础之上的，它的含义是如果一个地区能够观察到最多的遗传多样性，那么这个地区可能就是实验组的起源地，实验组在这里分化、然后再进一步从这里向外播散^[2]。本研究显示，中国3株土拉菌和日本FSC022一同位于B型系统进化结构中的基础位置，同时也表现出高水平的遗传多样性。那么是否可以认为，亚洲地区可能是subsp. holarctica的起源地？从1株全基因组测序的格鲁吉亚土拉菌中筛选出几个SNP，然后将这几个SNP放在全球系统进化分析的标记中，结果发现格鲁吉亚谱系被分配到B.Br.013内B.Br.026分支的基础位置，于是认为格鲁吉亚可能是B.Br.013更老的起源地^[6]。同理，将中国本土的土拉菌测序后补充新的SNP，放在subsp. holarctica的全球遗传进化背景下分析，可能会得出一些更接近于事实真相的结论。