中华流行病学杂志  2015, Vol. 36 Issue (12): 1410-1414   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.12.021
中华医学会主办。
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王艳华, 彭遥, 夏连续. 2015.
Wang Yanhua, Peng Yao, Xia Lianxu. 2015.
中国土拉弗朗西斯菌holarctica亚种的遗传多样性
Genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in China
中华流行病学杂志, 2015, 36(12): 1410-1414
Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(12): 1410-1414
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.12.021

文章历史

收稿日期: 2015-07-02
中国土拉弗朗西斯菌holarctica亚种的遗传多样性
王艳华 , 彭遥, 夏连续    
102206 北京, 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
摘要: 目的 研究国内外土拉弗朗西斯菌的遗传进化关系。方法 选择17个单核苷酸多态性、4个插入/缺失和12个可变数目串联重复,采用单核苷酸多态性和插入/缺失、多位点可变数目串联重复分析方法单独和组合起来对39株土拉菌(10株中国土拉菌和29株已公布测序的土拉菌)进行系统进化分析。结果 组合分析显示,3株中国土拉菌和日本的FSC022被分配到B5;剩余3株中国土拉菌和瑞典的FSC200被分配到B1;3株和美国的OSU18被分配到B2;1株和法国的FTNF002-00、德国的F92与美国的OR96246一起被分配到B4。10株中国土拉菌分为4种亚型,研究表明中国土拉菌具有广泛的遗传多样性。结论 本研究针对土拉菌B型建立了一套简易高效的分型方法,并以此为基础得出土拉菌B型的起源可能是亚洲地区。
关键词: 土拉弗朗西斯菌    土拉热    系统进化    单核苷酸多态性    插入/缺失    多位点可变串联重复分析    
Genetic diversity of Francisella tularensis subsp. holarctica in China
Wang Yanhua , Peng Yao, Xia Lianxu    
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract: Objective To explore the genetic relationship between the Chinese and the foreign species of Francisella tularensis. Methods Based on our own findings and from the literature, 17 SNP, 4 INDEL, and 12 VNTR were selected for phylogenetic analysis on 39 strains of F. tularensis, including 10 strains of Chinese F. tularensis and 29 strains of foreign F. tularensis that had been sequenced and published. SNP-INDEL and MLVA were used for the separation and combination. Results Data from the combined analysis indicated that 3 strains of Chinese F. tularensis with Japanese FSC022 were assigned to B5; 3 strains, with Swedish FSC200 to B1; 3 strains with American OSU18 to B2 and 1 strain with French FTNF002-00, German F92, and American OR96246 to B4, respectively. 10 strains of Chinese F. tularensis were assigned to 4 clades and the result demonstrated a wide diversity of F. tularensis subsp. holarctica in China. Conclusion A set of simple and robust typing tools for F. tularensis subsp. holarctica were established in this study. Based on the results, F. tularensis subsp. holarctica might have had its origins in Asia.
Key words: Francisella tularensis    Tularemia    Phylogeography    Single-nucleotide polymorphism    Insertion-deletion    Multiple-locus variable number tandem repeat analysis    

土拉弗朗西斯菌(土拉菌)是一种具有较强传染性的、能够引起土拉热的胞内寄生菌。土拉热主要由2个亚种引起:subsp. tularensis(A型)和subsp. holarctica(B型)。A型分布仅限于北美地区。B型亚种的研究主要集中在欧洲地区,根据地理分布特征,欧洲地区的土拉菌分为两个亚群[1]。在西班牙、法国和瑞士等国几乎分离的土拉菌都属于B.Br.FTNF002-00亚群[2, 3, 4, 5],而从捷克、俄罗斯等国分离的大多数土拉菌属于B.Br.013亚群内的多个谱系[2, 4, 6]。目前,B型各亚群在亚洲地区的分布不是很清楚,关于中国土拉菌B型亚种和欧美地区B型亚种之间关系的研究更是少见。为了解中国土拉菌和国外土拉菌在亚型上的异同点,从而能够在土拉热暴发和流行时进行菌株溯源。前期以单核苷酸多态性(SNP)为基础,初步进行了中国土拉菌的遗传进化关系研究[7]。本研究拟通过针对土拉菌B型亚种建立一套简易高效的分型方法,进行更加深入地探讨。

材料与方法

1. 土拉菌来源:本研究的10株中国土拉菌中,410105、 410108、410109、410111、410112、410113和920607来源于西藏,410116和410117来源于新疆,410107来源于黑龙江。另外,还有29个参考菌株,包括SCHU S4、FSC147、FTNF002-00、U112、WY96-3418、OSU18、LVS、FSC198、FSC033、MA00-2987、NE061598、257、FSC022、FSC200、GA99-3548、GA99-3549、RC503、MI001730、OR96246、F92、URFT1、ATCC6223、80700103、AS_713、831、70102010、TIGB03、TI0902和80700075,基因组信息获取网址:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/511或http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/francisella_tularensis_group/Regions.html。

2. 选择适合的SNP和插入/缺失(INDEL):根据前期研究[7],从fopA和tul4基因中选出6个SNP位点(F1、F2、F3、F4、F5和F6)。从以往用于B型亚种分型的遗传标记中[2, 4],选择更有效力的11个SNP位点(B2、B3、B4、B5、B6、B12、B16、B17、B19、B20和B23)和4个INDEL位点(Ftind33、Ftind38、Ftind48和Ftind49),共21个遗传标记作为本研究的靶位点(表1)。为了获得准确的SNP信息,对于中国土拉菌,所有的SNP位点都通过测序获得,F1~F6位点SNP状况从以前的测序结果中得到[7]。每个INDEL位点均通过2对引物(CP-IN和CP-OUT)扩增以确定是否有插入片段的存在。CP-OUT引物作为阳性对照。对于29个测序菌株,在基因组序列中通过比对上下游引物,可以找到相应位置的SNP位点以及确定检测片段的插入和缺失。

表 1 21个SNP和INDEL标记和引物

3. 选择适合的VNTR:不考虑A型亚种,仅考虑对于B型亚种分型能力较强,同时考虑时间和费用的最佳组合。从25个VNTR位点中,选出对于B型亚种分型能力较强的12个位点(Ft-M3、Ft-M4、Ft-M6、Ft-M8、Ft-M10、Ft-M13、Ft-M16、Ft-M18、Ft-M20、Ft-M21、Ft-M22和Ft-M24),引物序列和退火温度参照文献[8]。通过PCR方法在10株中国土拉菌中12个VNTR位点重复扩增3次。在每个VNTR位点,保证每种片段长度的PCR产物都要通过测序来获得碱基序列,再查找重复基元的拷贝数。对于29个参考菌株,在基因组序列中通过比对上下游引物找到12个VNTR区域,再查找重复基元的拷贝数。

4. 系统进化分析:采用PAUP 4.0b10软件建立系统进化树,采用最大似然法(MP)构建,MP分析采用50次替换。引导分析用1 000次替换的启发式研究,节点值小于50被剔除。

结 果

1. SNP-INDEL分析:21个SNP和INDEL在39株土拉菌中的分布情况见图1

图 1 21个SNP和INDEL在39株土拉菌中的分布 注:对于SNP,菌株状况和SCHU S4一致的,用○表示,反之则用●表示; 对于INDEL,缺失用○表示,插入则用●表示

SNP-INDEL分析能够很好地将4个亚种区分出来,而且,不仅能够将A型的两个主要分支A1和A2区分开,对于B型也能够将日本土拉菌和北半球其他国家的土拉菌区分开(图2A)。从主干到分支的进化分析为:F1可以将subsp. novicida区分开;F2和F6可以将subsp. tularensis区分开;F3可以将subsp. holarctica区分开。在subsp. tularensis内,F4可以将A2区分出来,F5可以进一步将毒力弱的ATCC6223和其他A2菌株区分出来。引导分析的节点值大于50的,在节点左上方标出(图2),在节点的左下方标出了分型标记(图2A)。

图 2 采用SNP-INDEL、MLVA单独和组合方法分析土拉菌之间的遗传进化关系

2. MLVA分析:MLVA不能将subsp. novicida和subsp. mediasiatica区分开,能够将A型中的A1和A2以及B型中的日本来源菌株和其他来源菌株区分开(图2B)。在树状图主干进化支上,SNP-INDEL的节点值较高(图2A),而MLVA的节点值均低于50(图2B)。

3. 组合分析:SNP-INDEL和MLVA组合分析显示,与SNP-INDEL、MLVA单独分析相比,在远端分支上的节点值增加(图2C),这说明对于菌株间的区分能力增强。组合分析方法将subsp. holarctica分为5个亚型,分别命名为B1~B5。值得注意的是,中国的10株土拉菌分到了4个亚型中,3株和瑞典的FSC200分到B1;3株和美国的OSU18分到B2;1株和法国的FTNF002-00、德国的F92、美国的OR96246分到B4;最后3株和日本的FSC022分到B5。

讨 论

细菌的分子分型和系统进化分析的方法很多,目前一致认为,SNP是缓慢突变的标记,在分支的主干上能够保证系统进化分类的正确性;而MLVA是非常快速突变的标记,在远端的分支上对各亚种内的菌株个体能够进行细致的区分。如果将SNP和MLVA组合,能够互补不足、发挥各自的优势,达到更加理想的分析效果。另外,INDEL能够增加SNP在主要进化节点上的支持度和结果的可靠性,并增强节点上的分辨力[4, 9]。因此,将SNP-INDEL和MLVA组合起来,在主干进化支上SNP-INDEL保证分类的正确性和可靠性,在远端进化支上MLVA对菌株个体进行细致的区分,二者组合就会对土拉菌的进化分析提供更高的精确性和分辨力[10]。为了最小化遗传标记的数量,根据前期的工作[7]和以往的研究结果[2, 4],选出17个SNP和4个INDEL建立了一个分型系统。SNP-INDEL和MLVA单独分析构建的树状图,虽然在分类上略有不同,但是对于所有B型菌株均分为日本土拉菌和非日本土拉菌,在这两个亚组的主要分界点上是一致的。本研究显示:SNP-INDEL和MLVA组合分析,既在主干系统进化关系上获得了更高的精确性,同时对于亚种内的菌株个体之间又表现出更强的分辨力。因此,本研究针对土拉菌B型亚种建立了一套简易高效的分型方法。

在本研究的SNP-INDEL分析中,测序菌株SCHU S4、FSC033和WY96-3418、ATCC6223分别被分到A1和A2亚群中,分类结果与Svensson等[4]一致。与SNP-INDEL相比,MLVA明显地表现出较高的多态性,对描述菌株个体的特征很有帮助。组合分析方法将subsp. holarctica分为5个亚型(B1~B5),和Svensson等[4]的分析结果一致。中国10株土拉菌被分配到4个亚型中,表现出多样性的遗传特征。虽然设计时选择的遗传标记未考虑subsp. tularensis,但SNP-INDEL和MLVA组合分析同样也能将subsp. tularensis区分为两个主要亚群,只是未能将subsp. novicida和subsp. mediasiatica区分开。

一项日本研究显示:日本33株菌中有31株被分配到在ClusterⅠ,仅有2株和其他国家来源的菌株被分配在ClusterⅡ,表明日本菌株具有显著的本国特有的遗传特征[11]。值得注意的是,在SNP- INDEL和MLVA的单独、以及二者的组合分析中,中国土拉菌410108、410109、410111和日本的FSC022均被分配到一个分支,这说明中国土拉菌和日本土拉菌具有某些相同的遗传特征。由图1可看到,3株中国土拉菌在B2、B3的SNP状况与FSC022完全相同,而和其他的subsp. holarctica的SNP状况都不相同。另外,在B16中国这3株土拉菌的SNP状况仍然与FSC022完全相同,而其他包括4个亚种的35株土拉菌的SNP状况都和这4株菌的不同。按照Svensson等[4]的推论,中国这3株土拉菌可以和日本土拉菌一同归入B5亚型。除本研究发现的中国菌株,到目前为止,其他采用SNP/MLVA分析方法,日本来源的菌株都是单独被分到一个亚组[2, 8, 9, 12],没有任何其他国家的菌株能和日本来源的菌株分到一起的。在SNP-INDEL和MLVA的组合分析中,除了B3是俄罗斯菌株独有的亚型外,其余4个亚型(B1、B2、B4和B5)都包含有中国土拉菌,再次证实中国土拉菌的遗传多样性[13]

目前研究认为,土拉菌subsp. holarctica之间的遗传差异性很小,说明这个亚种仅仅是最近克服了一个遗传学障碍才得以出现,然后迅速地播散到整个北半球[8, 9, 14, 15, 16, 17]。然而,对于subsp. holarctica的起源问题一直有争议。Vogler等[2]持两种观点,一种是根据FSC022在进化支中的基础位置,认为这个亚种可能起源于亚洲地区;另外,根据MIP SNP分析中加利福尼亚谱系也在较基础的位置,认为这个亚种也可能起源于北美,然后通过B辐射播散到现在分布的地区。遗憾的是,系统进化分析中的土拉菌数据仅包括了日本菌株,而没有亚洲地区其他来源的菌株。这些假设是建立在一个中心多样性的理论基础之上的,它的含义是如果一个地区能够观察到最多的遗传多样性,那么这个地区可能就是实验组的起源地,实验组在这里分化、然后再进一步从这里向外播散[2]。本研究显示,中国3株土拉菌和日本FSC022一同位于B型系统进化结构中的基础位置,同时也表现出高水平的遗传多样性。那么是否可以认为,亚洲地区可能是subsp. holarctica的起源地?从1株全基因组测序的格鲁吉亚土拉菌中筛选出几个SNP,然后将这几个SNP放在全球系统进化分析的标记中,结果发现格鲁吉亚谱系被分配到B.Br.013内B.Br.026分支的基础位置,于是认为格鲁吉亚可能是B.Br.013更老的起源地[6]。同理,将中国本土的土拉菌测序后补充新的SNP,放在subsp. holarctica的全球遗传进化背景下分析,可能会得出一些更接近于事实真相的结论。

参考文献
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