空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是引起人类急性腹泻常见的人兽共患病原菌。贵州省从2010年开始对感染性腹泻病例中空肠弯曲菌感染进行监测，结果显示，其检出率仅次于沙门菌^[1]，提示空肠弯曲菌也是贵州省引起腹泻的主要病原菌之一，2012年贵州省首次从菌血症患儿血液标本中检出空肠弯曲菌^[2]。因此加强空肠弯曲菌的监测及了解其病原特征，对贵州省空肠弯曲菌病的预防控制具有重要意义。本研究采用PCR方法对空肠弯曲菌分离株进行种型及亚种鉴定，并应用多位点序列分型（MLST）方法进行分析。

1. 材料与方法：

（1）菌株来源：10株空肠弯曲菌疑似菌株中9株分离自2010－2013年贵州省腹泻症候群监测病例粪便、1株分离自菌血症患儿全血培养物。

（2）细菌基因组DNA提取：将菌株接种至哥仑比亚血平板，42 ℃微需氧培养箱（85% N₂，10% CO₂，5% O₂）培养48 h后，按试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。

（3）空肠弯曲菌的多重PCR鉴定：采用文献[3]提供的空肠弯曲菌16S RNA、mapA引物序列和参数对分离株进行种型鉴定，采用文献[4]提供的空肠弯曲菌nap基因引物序列及扩增程序进行亚种鉴定。

（4）空肠弯曲菌管家基因PCR扩增：根据空肠弯曲菌 MLST数据库提供的空肠弯曲菌7个管家基因aspA、gltA、glnA、 glyA、 pgm、 tkt、 uncA引物及PCR扩增参数进行扩增。

（5）MLST分型分析：PCR扩增产物经纯化后，用测序引物进行双向测序，将测序序列与相应基因的标准序列进行比对并截为标准长度，在空肠弯曲菌MLST数据库中进行比对，获得各菌株的等位基因谱及序列型（squence type，ST）。采用Bionumerics 6.6软件对贵州省菌株的各管家基因数据与我国北方地区空肠弯曲菌菌株的MLST等位基因数据进行聚类分析^[5]。

2. 结果：

（1）多重PCR方法鉴定空肠弯曲菌：种型鉴定多重PCR显示，10株分离株均获得857 bp（16S RNA）及589 bp（mapA）特异性扩增片断；亚种nap基因扩增显示，10株菌均扩增出1 454 bp和1 016 bp的2条特异性条带。

（2）管家基因PCR扩增：10株空肠弯曲菌株核酸进行7个管家基因aspA、gltA、glnA、glyA、pgm、tkt、uncA PCR扩增后，均扩增出预期大小的目的基因片段。

（3）MLST分析：10株空肠弯曲菌分成8个ST型，其中GZ201001、GZ201002和GZ201201具有相同的序列型（ST-2274），占30%，同时发现2个新的ST型（ST-7118和ST-7119）。6株空肠弯曲菌归属4个克隆群（ST-353 3株，ST-21、ST-460和ST-45各1株），另外4株MLST数据库未给出对应的克隆群。将贵州省空肠弯曲菌临床分离株MLST数据与我国北方地区空肠弯曲菌MLST数据进行聚类分析，结果显示，贵州省空肠弯曲菌临床分离株除GZ201003外与我国北方的分离株聚类较近，相似性＞80%，见图 1。

图 1 贵州省空肠弯曲菌临床分离株与我国北方地区空肠弯曲菌MLST聚类分析

图选项

3. 讨论：本研究显示，10株空肠弯曲菌分离株均为空肠亚种。MLST分型结果显示，10株菌分成8个ST型，其中2个为新的ST型（ST-7118和ST-7119），大多数型别（7/10）散在分布，6株空肠弯曲菌归属4个克隆群，另外4株在MLST数据库中未显示对应的克隆群，提示贵州省空肠弯曲菌临床分离株存在明显的遗传多态性。此外，8个ST型中，3株分离株具有相同的序列型（ST-2274），是贵州省临床分离株的主要序列型，Zhang等^[5]的研究显示，ST-2274主要分离自鸡肉或鸡粪。与我国北方地区部分菌株的MLST聚类分析显示，除菌株GZ201003外与我国北方的空肠弯曲菌聚类较近，相似性＞80%。贵州省腹泻人群空肠弯曲菌的主要克隆群为ST-353（30%），与我国北方地区腹泻人群分离株的研究结果一致^[5]，Cody等^[6]的研究在英国该克隆群主要来源于鸡，被空肠弯曲菌污染的禽肉是引起人类临床感染的主要因素。本研究提示，鸡可能是贵州省空肠弯曲菌感染的主要来源，在加强临床病例监测的同时，还应加强禽类尤其鸡来源的空肠弯曲菌监测。由于样本数量有限，本研究结果是否具有代表性还需进一步监测。