肠出血性大肠埃希菌（EHEC）是致泻性大肠埃希菌的一个亚型，主要致病菌株为O157 ∶ H7。本研究对分离自河南省病例、家禽家畜粪便及食品等外环境的EHEC O157进行病原学与分子生物学检测、分型，了解其病原学特点，为相关疾病的监测、暴发预警与溯源提供数据。

1. 菌株来源：2009－2010年河南省腹泻病多病原监测系统中郑州（登封、荥阳）与商丘市睢县2个监测哨点疾病预防控制中心（CDC）收集并分离自病例、家禽家畜粪便及食品的62株EHEC O157，其中患者粪便来源8株，食品来源8株，家禽家畜粪便来源46株。

2. 研究方法：

（1）分离培养与鉴定：5 g病例或动物粪便标本接种于45 ml mEC肉汤中，食品标本取25 g磨碎，接种于225 ml mEC肉汤中，37 ℃增菌培养6 h；EHEC O157免疫磁珠富集后接种Chromagar O157平板，37 ℃培养16～18 h；挑取疑似EHEC 菌落（紫红色或蓝心无色半透明、突起、光滑、湿润），API20E系统生化鉴定后转营养琼脂平板37 ℃过夜培养后进行O157、 H7两种单克隆抗体玻片凝集试验，阳性菌株进行PCR鉴定与毒力基因检测。

（2）多重 PCR检测：采用热裂解法制备模板，引物5对针对EHEC O157保守与毒力基因设计。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析^[1]。

（3） PFGE分型：PCR产物经限制性内切酶XbaⅠ（75 U）37 ℃酶切2 h后进行电泳。电泳参数：分子质量30～600 kb，脉冲时间2.16～54.17 s，电场角度120°，电泳时间19 h（1×TBE，14 ℃）。胶块用GelRed染料染色后凝胶成像仪去过饱和成像。BioNumerics 6.0软件分析（UPGMA，PT 1.5%）。

3. 结果：

（1）EHEC的鉴定：64株EHEC经血清学凝集试验鉴定均为EHEC O157（＋） ∶ H7（-）。2株携带志贺毒素1型（stx1）毒力基因，11株携带黏附素（eaeA）与溶血素（hlyA）毒力基因，其余49株为非产毒菌株。2株产stx1毒力基因菌株分离自牛粪；3株产eaeA＋hlyA毒力基因菌株分离自病例，其中2株分离自男性（0.5～1岁），1株分离自女性（25岁）；另外8株产eaeA＋hlyA毒力基因菌株分离自家禽家畜粪便；非产毒型O157菌株分离自病例（3株）、食品（8株）、家禽家畜粪便（38株），见表 1。

表 1 EHEC O157 PCR检测毒力基因

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（2）PFGE鉴定：62株菌PFGE分为49种带型，命名为EH1～EH49，相似度为62.3%～100.0%，带型内包含菌株数为1～4株。EH3与EH27两种带型毒力基因型别均为eaeA＋hlyA；EH4/EH6/EH7/EH23/EH24/EH40/EH47带型菌株分离自家禽家畜粪便，均为非产毒型EHEC O157；EH22内1株携带eaeA＋hlyA基因，1株为非产毒型EHEC O157；EH41带型毒力谱较复杂：2株菌携带Stx1志贺毒素，1株菌携带eaeA与hlyA毒力基因，1株菌未携带毒力基因。从整体看，EHEC O157的核酸序列多态性更多，带型聚集性更分散，分离自不同监测点与不同样本类型的菌株带型相似度较低（＜80%），人源与食品、环境源菌株从宏、微观角度看均未呈现聚集性，与毒力基因的关联性也不强（图 1）。

图 1 EHEC O157 的PFGE聚类分析

图选项

3. 讨论：近年来，由EHEC引起的腹泻暴发逐步受到全球许多国家公共卫生机构的重视。研究表明，牛、鸡、羊、犬、猪等动物及其制品作为传染源的作用尤其重要^[2]。从本研究结果看，河南省家禽家畜的带菌率相当高，动物粪便分离株的比重约占77.4%；2株产志贺毒素stx1的菌株来自牛粪，11株产eaeA/hlyA的菌株则分布在病例、动物粪便和肉类制品中。同河南省和周边省份历史监测数据相比，河南省EHEC O157仍然是以家禽家畜为主要感染宿主，带菌率最高的宿主动物由羊变为牛，菌株携带的志贺样毒力基因由stx2变为stx1^{[3, 4]}。以EHEC 为代表的食源性疾病防制重点仍是在畜牧业/养殖业的饲养、屠宰和食品加工等环节。从病例看，＜10岁低龄儿童是EHEC感染高发人群，需要予以重点关注。

从PFGE带型看，大多数带型间既未呈现较高的相似度，也未发现有优势带型与聚集现象。人源菌株带型各自独立分布，未发现与动物源和食品分离菌株一致或高度相似带型。同河南省历史菌株分型结果相比，带型种类由9种增加到49种，多态性大大增加。考虑到食源性疾病传播模式的特点，对动物源和人源菌株关联度及疾病传播链的追溯还需通过优化PFGE参数、变更限制性多态位点或结合其他分子分型技术进一步验证和研究。