文章信息
- 赵嘉咏, 穆玉姣, 张白帆, 李孟磊, 苏佳, 夏胜利, 黄学勇, 许汴利.
- Zhao Jiayong, Mu Yujiao, Zhang Baifan, Li Menglei, Su Jia, Xia Shengli, Huang Xueyong, Xu Bianli.
- 河南省2009-2010年出血性大肠埃希菌O157毒力基因分布与脉冲场凝胶电泳分型研究
- Distribution of virulence genes and PFGE molecular typing of Entero-hemorrhagic Escherichia coli O157 in Henan from 2009 to 2010
- 中华流行病学杂志, 2015, 36(11): 1324-1326
- Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(11): 1324-1326
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.11.028
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文章历史
- 投稿日期: 2015-04-26
肠出血性大肠埃希菌(EHEC)是致泻性大肠埃希菌的一个亚型,主要致病菌株为O157 ∶ H7。本研究对分离自河南省病例、家禽家畜粪便及食品等外环境的EHEC O157进行病原学与分子生物学检测、分型,了解其病原学特点,为相关疾病的监测、暴发预警与溯源提供数据。
1. 菌株来源:2009-2010年河南省腹泻病多病原监测系统中郑州(登封、荥阳)与商丘市睢县2个监测哨点疾病预防控制中心(CDC)收集并分离自病例、家禽家畜粪便及食品的62株EHEC O157,其中患者粪便来源8株,食品来源8株,家禽家畜粪便来源46株。
2. 研究方法:
(1)分离培养与鉴定:5 g病例或动物粪便标本接种于45 ml mEC肉汤中,食品标本取25 g磨碎,接种于225 ml mEC肉汤中,37 ℃增菌培养6 h;EHEC O157免疫磁珠富集后接种Chromagar O157平板,37 ℃培养16~18 h;挑取疑似EHEC 菌落(紫红色或蓝心无色半透明、突起、光滑、湿润),API20E系统生化鉴定后转营养琼脂平板37 ℃过夜培养后进行O157、 H7两种单克隆抗体玻片凝集试验,阳性菌株进行PCR鉴定与毒力基因检测。
(2)多重 PCR检测:采用热裂解法制备模板,引物5对针对EHEC O157保守与毒力基因设计。扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析[1]。
(3) PFGE分型:PCR产物经限制性内切酶XbaⅠ(75 U)37 ℃酶切2 h后进行电泳。电泳参数:分子质量30~600 kb,脉冲时间2.16~54.17 s,电场角度120°,电泳时间19 h(1×TBE,14 ℃)。胶块用GelRed染料染色后凝胶成像仪去过饱和成像。BioNumerics 6.0软件分析(UPGMA,PT 1.5%)。
3. 结果:
(1)EHEC的鉴定:64株EHEC经血清学凝集试验鉴定均为EHEC O157(+) ∶ H7(-)。2株携带志贺毒素1型(stx1)毒力基因,11株携带黏附素(eaeA)与溶血素(hlyA)毒力基因,其余49株为非产毒菌株。2株产stx1毒力基因菌株分离自牛粪;3株产eaeA+hlyA毒力基因菌株分离自病例,其中2株分离自男性(0.5~1岁),1株分离自女性(25岁);另外8株产eaeA+hlyA毒力基因菌株分离自家禽家畜粪便;非产毒型O157菌株分离自病例(3株)、食品(8株)、家禽家畜粪便(38株),见表 1。
(2)PFGE鉴定:62株菌PFGE分为49种带型,命名为EH1~EH49,相似度为62.3%~100.0%,带型内包含菌株数为1~4株。EH3与EH27两种带型毒力基因型别均为eaeA+hlyA;EH4/EH6/EH7/EH23/EH24/EH40/EH47带型菌株分离自家禽家畜粪便,均为非产毒型EHEC O157;EH22内1株携带eaeA+hlyA基因,1株为非产毒型EHEC O157;EH41带型毒力谱较复杂:2株菌携带Stx1志贺毒素,1株菌携带eaeA与hlyA毒力基因,1株菌未携带毒力基因。从整体看,EHEC O157的核酸序列多态性更多,带型聚集性更分散,分离自不同监测点与不同样本类型的菌株带型相似度较低(<80%),人源与食品、环境源菌株从宏、微观角度看均未呈现聚集性,与毒力基因的关联性也不强(图 1)。
3. 讨论:近年来,由EHEC引起的腹泻暴发逐步受到全球许多国家公共卫生机构的重视。研究表明,牛、鸡、羊、犬、猪等动物及其制品作为传染源的作用尤其重要[2]。从本研究结果看,河南省家禽家畜的带菌率相当高,动物粪便分离株的比重约占77.4%;2株产志贺毒素stx1的菌株来自牛粪,11株产eaeA/hlyA的菌株则分布在病例、动物粪便和肉类制品中。同河南省和周边省份历史监测数据相比,河南省EHEC O157仍然是以家禽家畜为主要感染宿主,带菌率最高的宿主动物由羊变为牛,菌株携带的志贺样毒力基因由stx2变为stx1[3, 4]。以EHEC 为代表的食源性疾病防制重点仍是在畜牧业/养殖业的饲养、屠宰和食品加工等环节。从病例看,<10岁低龄儿童是EHEC感染高发人群,需要予以重点关注。
从PFGE带型看,大多数带型间既未呈现较高的相似度,也未发现有优势带型与聚集现象。人源菌株带型各自独立分布,未发现与动物源和食品分离菌株一致或高度相似带型。同河南省历史菌株分型结果相比,带型种类由9种增加到49种,多态性大大增加。考虑到食源性疾病传播模式的特点,对动物源和人源菌株关联度及疾病传播链的追溯还需通过优化PFGE参数、变更限制性多态位点或结合其他分子分型技术进一步验证和研究。
[1] Beutin L, Jahn S,Fach P. Evaluation of the ‘GeneDisc’ real-time PCR system for detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O26,O103,O111,O145 and O157 strains according to their virulence markers and their O- and H-antigen-associated genes[J]. J Appl Microbiol,2009,106(4): 1122-1132. |
[2] Kim Y,Oh S,Park S,et al. Interactive transcriptome analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157:H7 and intestinal epithelial HT-29 cells after bacterial attachment[J]. Int J Food Microbiol,2009,131(2/3):224-232. |
[3] Xia SL,Shen GJ,Jin HJ,et al. Study on emerging infectious diseases of EHEC O157:H7 in Henan province[J]. Mod Prev Med,2008,35(23):4691-4694. (in Chinese) 夏胜利,沈刚健,靳会娟,等. 河南省新发传染病EHEC O157:H7监测研究[J]. 现代预防医学,2008,35(23):4691-4694. |
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