登革热病毒（DENV）通过蚊虫叮咬进行传播，DENV感染后可引起登革热（DF）、登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）。在全世界范围内，主要分布在热带和亚热带地区。在我国主要分布在广东、福建、浙江和云南等地区。DENV属黄病毒科黄病毒属，是单股正链RNA病毒，基因组全长约11 kb，包括4个血清型，每个血清型又分不同基因亚型。2013年以前河南省未发生过DF本地流行，偶有输入性病例报告。2013年河南省禹州市首次出现DF暴发疫情^[1]，共有73例确诊病例报告，本研究对这次暴发疫情的DENV基因组序列进行分析。

1. 材料与方法：

（1）标本来源：血清标本来源于河南省禹州市DF患者，-70 ℃保存。所有标本采集均经知情同意。

（2）病毒分离及鉴定：将27份急性期血清标本接种于单层非洲绿猴肾细胞（Vero），36 ℃ 5%CO₂培养箱培养，盲传3代后收集出现细胞病变的培养物，用于序列扩增及鉴定分型。

（3）RT-PCR扩增及序列测定：病毒阳性分离产物首先使用DENV核酸荧光RT-PCR试剂（江苏硕士股份有限责任公司）进行鉴定分型，初步鉴定后参照文献^[2]进行基因组分段扩增并测序。

（4）序列分析：使用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行序列拼接，拼接后的序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站进行BLAST，初步发现同源序列。使用DNAStar 5.01软件包中的MegAlign软件分析核苷酸序列同源性，最后用Mega 5.05软件采用最大似然法构建进化树（Bootstrap＝1 000）。本次分离得到9株DENV分离株的核苷酸序列提交至GenBank数据库。遗传进化树中的DENV毒株命名规则为国家（省份）/毒株来源日期/ GenBank 序列号。

2. 结果：

（1）病毒分离及鉴定：病毒培养后，收集12份阳性分离物上清，保存于-70 ℃冰箱。所有阳性病毒分离产物经DENV核酸荧光RT-PCR试剂鉴定，分型为DENV-3核酸阳性。

（2）全基因组序列测定及分析：经分段扩增测序，共获得9株病毒的全基因序列，将序列提交GenBank，序列号为KJ622191～KJ622199。基因组全长约10 710 bp，测序结果经过BLAST分析，所有序列与DENV-3同源性最高。含有一个开放读码框，编码3 390 个氨基酸。两端各有一个非翻译区，长度分别为94 个核苷酸和约444个核苷酸。

（3）核苷酸和氨基酸序列同源性比较：引起此次DF暴发的9株病毒分离株之间全基因组核苷酸同源性为99.9%～100.0%，编码区氨基酸同源性为99.9%～100.0%。GenBank中同此批分离株同源性最高的为2013年的中国云南省分离株YN1/2，其中基因组核苷酸同源性为99.5%～99.6%，编码区氨基酸同源性为99.7%～99.8%；其次为1987年分离的泰国株ThD3_0010_87，基因组核苷酸同源性为97.6%～97.7%，编码区氨基酸同源性为99.2%～99.3%。

（4）进化树分析：将9株DENV-3分离株E基因序列与GenBank下载的不同国家、不同年份、不同基因亚型的其他27株DENV毒株序列构建进化树，以1945年分离于美国的DENV-1型毒株序列作为外围序列。DENV-3共由5个基因型（Ⅰ～Ⅴ）组成，近年来，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型在我国东南沿海地区及与我国临近的东南亚国家均有出现。此次暴发的分离株自成一簇，关系最近的为同年分离于云南省的YN1/2 DENV毒株，其次为马来西亚分离株，见图 1。

注：● 本研究分离株 图 1 DENV-3 病毒分离株全长E编码区 核苷酸序列进化树

图选项

3. 讨论：2013年，在广东省^[3]和云南省^{[4, 5]}均出现了DF疫情，并且存在不同血清型的DENV混合流行。云南省景洪市在2013年8月开始出现了由DENV-3引起的DF疫情^[5]，河南省禹州市也在该时间段出现DF病例，并且引起本地流行，具有家庭聚集性现象^[2]。而且，引起河南省此次DF疫情的DENV分离株同2013年的云南省DENV-3分离株全基因组核苷酸序列具有高度同源性（99.5%～99.6%）。进化树也显示，两者关系最近，同属GⅡ。近年来，该血清型的DENV在东南亚地区长期流行，所以，冯云等^[4]推测2013年中国云南省景洪市DF疫情与2013年6－8月来自老挝等相邻国家的DF输入性病例（或隐性感染者）密切相关。2013年河南省首次出现的DF暴发疫情发生在禹州地区，当地属于钧瓷产地，长期和我国东南沿海及东南亚国家存在着贸易往来。流行病学调查显示，疫情出现前期，当地就曾有马来西亚归国人员，同我国东南沿海省份的往来也非常频繁。

[感谢河南省许昌和禹州市疾病预防控制中心工作人员的大力支持]