中华流行病学杂志  2015, Vol. 36 Issue (10): 1162-1166   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.10.027
中华医学会主办。
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于栓宝, 李文革, 车洁, 边富宁, 卢金星, 吴媛.
Yu Shuanbao, Li Wenge, Che Jie, Bian Funing, Lu Jinxing, Wu Yuan.
热带假丝酵母菌临床分离株毒力表型特征研究
Study on virulence factors of Candida tropicalis isolated from clinical samples
中华流行病学杂志, 2015, 36(10): 1162-1166
Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(10): 1162-1166
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.10.027

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投稿日期: 2015-02-15
热带假丝酵母菌临床分离株毒力表型特征研究
于栓宝, 李文革, 车洁, 边富宁, 卢金星, 吴媛     
102206 北京, 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室 感染性疾病诊治协同中心
摘要: 目的 描述临床分离的热带假丝酵母菌培养不同时间的天冬氨酰蛋白酶活性(蛋白酶活性)、磷脂酶活性和溶血活性,并分析不同感染部位分离菌的蛋白酶活性和溶血活性差异。方法 将分离自不同感染部位的热带假丝酵母菌鉴定后分别接种在牛血清蛋白培养基、卵黄琼脂培养基和羊血琼脂培养基上,培养不同时间(24、48和72 h)后检测蛋白酶活性、磷脂酶活性和溶血活性。结果 热带假丝酵母菌培养24、48和72 h时均具有蛋白酶活性和溶血活性,但未表现出磷脂酶活性;热带假丝酵母菌在48 和72 h时的蛋白酶活性高于其在24 h时的活性,在72 h范围内,溶血活性随培养时间延长持续增长;分离自不同感染部位的热带假丝酵母菌的蛋白酶活性(P=0.368)和溶血活性(P=0.985)差异无统计学意义。结论 我国热带假丝酵母菌临床分离株培养不同时间具有蛋白酶活性和溶血活性,但无磷脂酶活性。
关键词: 热带假丝酵母菌     毒力因子     天冬氨酰蛋白酶     磷脂酶     溶血活性    
Study on virulence factors of Candida tropicalis isolated from clinical samples
Yu Shuanbao, Li Wenge, Che Jie, Bian Funing, Lu Jinxing, Wu Yuan     
State Key Laboratory for Communicable Diseases Prevention and Control, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China
Abstract: Objective To determine the in vitro production of virulence factors for Candida(C.) tropicalis,including aspartyl proteinases,phospholipases and hemolytic activities,describe the regulation of virulence factors varying with time in C. tropicalis,and analyze the differences in aspartyl proteinases and hemolytic activities of C. tropicalis isolated from anatomically distinct sites. Methods A total of 64 C. tropicalis strains were spot-inoculated onto bovine albumin agar,egg yolk agar and sheep blood agar plates,respectively. Then the plates were incubated for 24,48 and 72 hour at 37 ℃,respectively. The aspartyl proteinases,phospholipase and hemolytic activities were determined at each time point,respectively. Results All the C. tropiclais isolates showed positive aspartyl proteinases and hemolytic activities at each time point,but no phospholipases activity was detected in C. tropicalis. On comparison of aspartyl proteinases and hemolytic activities at different time points, aspartyl proteinases activity at 48 and 72 hour was higher than that at 24 hour. During 72 hour,hemolytic activity of C. tropicalis increased. No statistical significant differences in aspartyl proteinases and hemolytic activities of C. tropicalis were observed among different infection sites (P=0.368 and 0.985). Conclusion The C. tropicalis clinical isolates in China have aspartyl proteinases activity,hemolytic activity,but have no phospholipase activity.
Key words: Candida tropicalis     Virulence factors     Aspartyl proteinases     Phospholipases     Hemolytic activity    

随着免疫功能不全、长期住院患者、实施侵袭性检查和治疗人数的增多,假丝酵母菌已成为一种重要的机会致病菌[1],可引起浅表和/或侵袭性感染[2, 3, 4]。尽管感染主要由白假丝酵母菌导致,但近年来由非白假丝酵母菌引起的侵袭性真菌感染率逐年上升,而热带假丝酵母菌是最流行的致病性非白假丝酵母菌之一[5]。研究表明假丝酵母菌的致病性与一系列毒力因子有关,包括天冬氨酰蛋白酶活性(蛋白酶活性)、磷脂酶活性和溶血活性等。目前,国内外关于假丝酵母菌毒力表型特征研究多集中于白假丝酵母菌,而关于热带假丝酵母菌毒力因子的研究仍不清楚。国内热带假丝酵母菌的分子型别与国外存在差异,形成3 个独立的克隆群[6]。有必要对中国临床分离的热带假丝酵母菌毒力表型特征进行研究。本研究将对热带假丝酵母菌的蛋白酶、磷脂酶和溶血活性开展研究。

材料与方法

1. 实验菌株:收集热带假丝酵母菌临床株64 株,均来自中日友好医院。菌株分离自8 个感染部位:血液(n=1)、尿道(n=3)、排泄物(n=5)、前列腺分泌物(n=1)、脓液(n=1)、痰液(n=31)、咽拭子(n=3)、尿液(n=10)、阴道分泌物(n=4)和标本来源未知(n=5)。菌株经念珠菌API AUX 20C(bioMérieux)生化鉴定和转录间隔区(InternalTranscribed Spacer,ITS)测序鉴定为热带假丝酵母菌。质控菌株为热带假丝酵母菌ATCC750 和白色假丝酵母菌ATCC753,均购买自美国模式培养物集存库(ATCC)。实验菌株用脑心浸液(英国oxoid 公司)-80 ℃保存。

2. 菌悬液制备:将待测热带假丝酵母菌接种于SDA 培养基上,25 ℃孵育48 h,挑取单克隆继续接种于SDA培养基上,37 ℃孵育24 h。收集菌株,用PBS 洗3 次,制成PBS 菌悬液。将制好的菌悬液分别接种到含特定酶底物的平板(牛血清蛋白、卵黄琼脂和羊血琼脂培养基)上,测定其水解酶活性[7]

3. 酶活性测定:

(1)蛋白酶活性测定:将菌悬液浓度调至1×108 CFU/ml(A490=2.5),用微量移液器吸取5 μl 菌悬液点接种到牛血清蛋白培养基上,在37℃,5% CO2条件下培养24、48 和72 h 后,分别测定其菌落直径和(菌落+沉淀环)直径。用PrZ 表示蛋白酶活性,PrZ=菌落直径/(菌落+沉淀环)直径。

(2)磷脂酶活性测定:将菌悬液浓度调至1×108 CFU/ml(A490=2.5),用微量移液器吸取5 μl 菌悬液点接种到卵黄琼脂培养基上,在37 ℃,5% CO2条件下培养24、48 和72 h 后,分别测定其菌落直径和(菌落+沉淀环)直径。用PhZ 表示其磷脂酶活性,PhZ=菌落直径/(菌落+沉淀环)直径。

(3)溶血活性测定:将菌悬液浓度调至1×107 CFU/ml(A490=1.3),用微量移液器吸取10 μl 菌悬液点接种到羊血培养基上,在37 ℃,5% CO2条件下培养24、48 和72 h 后,分别测定其菌落直径和(菌落+溶血环)直径。用HZ表示其溶血活性,HZ=菌落直径/(菌落+溶血环)直径。

(4)毒力表型特征分级:主要参考Galán- Ladero的分级标准[7]。PrZ、PhZ 和HZ 统一用PZ 表示。PZ<0.41 表示高毒力活性;0.41≤PZ<0.61 表示中等毒力活性;0.61≤PZ<1.00 表示低毒力活性;PZ=1.00表示无毒力活性。

4. 统计学分析:采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理,采用频数、M和四分位数间距进行统计学描述,采用Kruskal-Wallis H检验和Friedman M检验进行多组资料间的比较,采用Bonferroni 法进行两两比较。检验水准为α=0.05。

结果

1. 热带假丝酵母菌的蛋白酶活性、磷脂酶活性和溶血活性随时间变化规律:64 株热带假丝酵母菌在37 ℃条件下,孵育24、48 和72 h 后,均表现出蛋白酶和溶血活性(图 1),但未能检测到磷脂酶的分泌。以PrZ 为比较指标(PrZ 值越小,蛋白酶活性越强),有35 株(54.7%)热带假丝酵母菌在72 h 之内随时间延长,蛋白酶活性增强;17 株菌(26.6%)的蛋白酶活性在72 h 之内随时间增长,酶活性减弱;其余(18.8%)菌株的酶活性在48 h 之内随时间增长,酶活性增强,随后随时间延长,酶活性逐渐减弱(图 1图 2)。以HZ 为比较指标(HZ 值越小,溶血活性越强),在72 h 内,热带假丝酵母菌(除1 株,ZRCT17)的溶血活性均随时间延长而增强(图 1图 2)。经统计学Friedman M检验,热带假丝酵母菌在不同时间点的天冬氨酰蛋白酶和溶血活性差异有统计学意义(均P=0.000)。用Bonferroni 法进行两两比较,热带假丝酵母菌在24 h 时的蛋白酶活性低于其在48 和72 h 时的活性(均P=0.000),而48 和72 h 时的蛋白酶活性差异无统计学意义(P=0.295);热带假丝酵母菌在48 和72 h 时的溶血活性高于24 h 时的溶血活性(均P=0.000),72 h 时的溶血活性高于48 h时的溶血活性(P=0.000)。

注:□ 低蛋白酶活性;■ 高蛋白酶活性;○ 低溶血活性;● 高溶血活性 图 1 热带假丝酵母菌在不同时间点(24、48 和72 h)的蛋白酶活性和溶血活性

图 2 热带假丝酵母菌不同时间点的蛋白酶和溶血活性及其分级

2. 热带假丝酵母菌的蛋白酶活性和溶血活性:以48 h 时的蛋白酶活性作为衡量热带假丝酵母菌蛋白酶活性的指标,多数(96.88%)菌株表现出中等蛋白酶活性(表 1),各有1 株(1.56%)热带假丝酵母菌表现为低蛋白酶(ZRCT64)和高蛋白酶活性(ZRCT28),见图 1。热带假丝酵母菌在48 h 时表现出的低、中和高蛋白酶活性,见图 2。以72 h 时的溶血活性作为衡量热带假丝酵母菌溶血活性的指标,96.88%的热带假丝酵母菌均表现出中等溶血活性(表 1),分别有1 株(1.56%)热带假丝酵母菌表现出低溶血活性和高溶血活性,相应菌株编码为ZRCT41 和ZRCT47(图 1)。热带假丝酵母菌在72 h 时的低、中和高溶血活性见图 2

表 1 热带假丝酵母菌在不同时间点的天冬氨酰蛋白酶、 磷脂酶及溶血活性分级

3. 分离自不同感染部位的热带假丝酵母菌蛋白酶活性和溶血活性比较:蛋白酶活性最强的热带假丝酵母菌(ZRCT28)是尿液分离株(PrZ=0.394),表现为高蛋白酶活性;最弱(ZRCT64)的来自痰液标本(PrZ=0.626),表现为低蛋白酶活性。在已知标本来源的样本中,溶血活性最强和最弱的热带假丝酵母菌均来自痰液标本,HZ 分别为0.414 和0.655,相应菌株编码为ZRCT60 和ZRCT41,在该研究中溶血活性最强的热带假丝酵母菌ZRCT47(HZ=0.344)未能收集到其感染部位(图 3)。

本研究中样本来源最多的是痰液(31 份),占所有标本来源的48.4%,其次为尿液(共10 份),占15.6%,其他感染部位的标本均较少。痰液样本分离的热带假丝酵母菌的PrZ M=0.490,尿液样本来源菌株PrZ M=0.466,经两组独立样本比较的秩和检验,差异无统计学意义(P=0.119),见图 3;痰液和尿液标本的HZ M分别为0.481 和0.497,两者较相近(图 3)。经Kruskal-Wallis H 检验,未发现分离自不同感染部位的热带假丝酵母菌的PrZ 和HZ差异有统计学意义(P=0.368 和0.985),见图 3

注:“箱体”部分的上下两端表示上四分位数(P75)和下四分位数(P25);“箱体”的大小表示四分位数间距;上下两条“触须”表示扣除异常值之外的最大值和最小值;“○”表示大于1.5 倍四分位数间距的数值;“*”表示大于3 倍四分位数间距的数值;“-”代表该部位菌株数太少 图 3 不同感染部位热带假丝酵母菌的蛋白酶活性和溶血活性
讨论

天冬氨酰蛋白酶通过扰乱宿主的黏膜功能,降解其免疫蛋白和结构蛋白而促进热带假丝酵母菌在宿主内的定植和侵袭[4, 8, 9]。现有研究测量假丝酵母菌蛋白酶活性的时间点并未统一,多集中在24、48、72 和96 h[3, 4, 10, 11, 12],这些研究显示,热带假丝酵母菌蛋白酶活性在48 h 时达到最大,因此本研究选用48 h作为测量热带假丝酵母菌蛋白酶活性的时间节点。本研究中,热带假丝酵母菌均表现出蛋白酶活性,与Galán-Ladero 等[7] 的研究结果保持一致;而Tellapragada 等[13]和Deorukhkar 等[10]的研究中只发现部分菌株表现出蛋白酶活性。本研究结果显示多数热带假丝酵母菌(98.66%)表现为中等蛋白酶活性,各有1 株表现为低蛋白酶活性和高蛋白酶活性。而在其他一些研究中热带假丝酵母菌的蛋白酶活性较低,如Galán-Ladero 等[7]的研究中27.59%的菌株表现为中等蛋白酶活性,其余菌株表现为低蛋白酶活性;França 等[14]的研究显示,57.1%的热带假丝酵母菌表现为中等蛋白酶活性,其余菌株表现出低蛋白酶活性或未表现出蛋白酶活性。研究结果之间的差异可能是由于各研究中菌悬液浓度不同及菌株本身的生物学固有特性引起的。Tellapragada 等[13]和Costa 等[15]研究组发现血源性热带假丝酵母菌蛋白酶活性高于阴道和口腔分离株。本研究虽未发现分离自不同感染部位的热带假丝酵母菌的蛋白酶活性存在统计学差异,但尿液分离株PrZ 的M低于痰液标本,同时血液和前列腺分泌物的热带假丝酵母菌分离株的蛋白酶活性也较高,由于血液和前列腺分泌物等均为无菌标本,因此该研究结果提示致病性的热带假丝酵母菌蛋白酶活性较高。

磷脂酶能够使磷脂水解为脂肪酸,通过分解宿主细胞的膜磷脂而导致细胞膜通透性升高、完整性受损和受体暴露,从而促进假丝酵母菌的黏附和入侵[10]。本研究未检测到热带假丝酵母菌胞外磷脂酶的分泌,Tellapragada 等[13]和Samaranayake 等[16]的研究也均未发现热带假丝酵母菌表现出磷脂酶活性。然而,Deorukhkar 等[10]通过对不同来源的125 株热带假丝酵母菌进行研究,发现有72 株(57.6%)表现出磷脂酶活性;Galán-Ladero 等[7]研究发现在37 ℃条件下,孵育24 h 后,71.4%的热带假丝酵母菌表现出非常低的磷脂酶活性(0.81≤PhZ<0.99),但随着观察时间的增长,磷脂酶活性又逐渐消失,Galán-Ladero 等[7]认为这种变化是由不断生长的菌落掩盖了微小的沉淀环造成的。

溶血活性是指假丝酵母菌产生的溶血素破坏血红蛋白并促进假丝酵母菌铁元素利用的能力[17]。因为人体中没有游离铁的存在,多数病原菌只能通过利用溶血素分解含铁化合物来得到铁元素,所以溶血活性被视为假丝酵母菌生长繁殖及造成机体感染的一个重要毒力因子。现有研究测量假丝酵母菌溶血活性的时间点并未统一,本研究中热带假丝酵母菌(除1 株,ZRCT17)的溶血活性在72 h 内均随时间延长而增强,因此以72 h 时的溶血活性作为测量热带假丝酵母菌溶血活性的指标。本研究发现热带假丝酵母菌均表现出溶血活性,也有研究显示,热带假丝酵母菌具有溶血活性[4, 11, 17, 18]。研究结果显示除各有1 株(ZRCT41 和ZRCT47)热带假丝酵母菌表现为低溶血活性和高溶血活性外,其余(96.88%)热带假丝酵母菌均表现为中等溶血活性。在Galán-Ladero 等[7]的研究中也发现多数(89.66%)热带假丝酵母菌表现为中等溶血活性,较少菌株表现为低溶血活性或高溶血活性。在已知标本来源的样本中,溶血活性最弱和最强的菌株均来自于痰液标本,可能与本研究中较高比例(48.4%)的痰液标本有关;此外,在本研究中分离自不同感染部位的热带假丝酵母菌的溶血活性较相似,其他研究中也未发现分离自不同感染部位的热带假丝酵母菌和白色假丝酵母菌溶血活性存在差异[4, 14, 19]

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