丙型肝炎病毒（HCV）是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。HCV的传播途径和HIV类似，静脉注射吸毒是一个重要的传播途径。云南省处在从东南亚“金三角”毒品基地通往中国内地的陆上毒品运输线路上，由于贩毒和自身吸毒的存在，有大量的注射吸毒人员。相关研究显示云南省静脉注射吸毒人群（intravenous drug users，IDUs）中HCV的感染率接近80%。HCV基因组为单股正链RNA，易变异，目前可分为7个基因型及不同亚型。HCV基因型的研究对于了解HCV的疫情发展和地区分布具有重要的意义，此外HCV基因型还影响着丙型肝炎的临床发展，与抗病毒治疗的疗效和肝细胞癌的发生密切相关，并有助于HCV疫苗的研究。昆明市作为云南省会，流动人口数量大，有必要对HCV的变异趋势进行追踪，指导丙型肝炎的防治。本文对昆明市的IDUs开展了HCV的分子流行病学研究。 对象与方法

1. 研究对象：2014年4－7月在昆明市连续收集276份IDUs的血浆，通过两种HCV抗体酶联免疫试剂检测，199份样品为HCV抗体阳性。同时收集相关的流行病学资料。

2. 病毒RNA提取：使用Qiagen公司QIAamp Viral RNA 试剂盒，根据标准操作程序从140 μl样品中提取HCV RNA，在-80 ℃条件下保存。

3. 序列扩增和测定：采用巢式PCR扩增HCV的E1E2基因片段（H77：933～2 060）和NS5B基因片段（H77：8 340～9 233），所用引物和条件参见文献^[1]。使用TaKaRa公司One Step RNA PCR Kit （AMV）试剂盒，进行反转录及第1轮PCR扩增，反应体系为25 μl；使用Tiangen公司2×Taq PCR MasterMix试剂盒，进行第2轮PCR扩增，取第1轮反应产物5 μl，反应体系为50 μl。第2轮PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性样品送北京梓熙生物公司纯化和测序。

4. 亚型分析：序列测定后使用Gene Codes公司的Sequencher 5.1软件进行拼接，然后用Bioedit软件进行多序列比对和序列清理。获得的E1E2和NS5B基因区序列与HCV国际参考株比对后，用Mega 6.0软件构建neighbor-joining进化树分别确定不同基因的亚型，结合2 个基因片段的结果确定亚型。

5. 统计学分析：应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用χ²检验和Fisher精确概率法进行统计学分析。 结 果

1. 一般人口学特征：2014年4－7月，在昆明市的IDUs中收集HCV抗体阳性样品199份。经扩增和测序，获得E1E2基因序列108条，NS5B基因序列101条。结合两个基因区序列，通过构建系统进化树，125个样品获得基因分型结果，其中84个样品同时获得E1E2和NS5B基因区的分型，24个样品仅获得E1E2基因区的分型，17个样品仅获得NS5B基因区的分型。见图 1、2。

图 1 E1E2基因区系统进化树

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图 2 NS5B基因区系统进化树

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获得基因分型的125名研究对象的年龄在25～60岁间，平均44.2岁，性别比为2.9 ∶ 1。民族分布以汉族（91.2%，114/125）为主，其他民族占8.8%（11/125）。婚姻状况方面，已婚或同居占44.8%（56/125），未婚占36.0%（45/125），离异或丧偶占19.2%（24/125）。其中10.4%（13/125）的研究对象HIV-1抗体阳性。

2. HCV基因型：在获得基因分型的125个样品中，3b是主要的亚型，占48.8%（61/125）；其他亚型依次为3a（30.4%，38/125）、6n（14.4%，18/125）、6a（3.2%，4/125）和1b（3.2%，4/125）。各HCV亚型按性别、婚姻、民族和HIV-1抗体是否阳性的分布差异无统计学意义（表 1）。年龄分组以中位数来划分，分成了两组，结果显示两组间差异有统计学意义，在＜45岁组中HCV的亚型多样化，包括了所有检测到的5种亚型，而≥45岁组中仅3种亚型（3b、3a和6n）。

表 1 研究对象的人口学特征和HCV亚型分布

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分别计算不同亚型在E1E2和NS5B两个基因区的基因距离（表 2），结果显示3a、3b和6a亚型的基因距离大于1b和6n亚型的基因距离。3a、3b和6a 3种亚型中3b亚型毒株的基因距离大于3a亚型毒株。

表 2 昆明市IDUs中HCV不同亚型的基因距离

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从全球流行情况来看，HCV基因型的分布存在着地区差异。总体上，1a、1b、2a、2b和3a成全球分布，而4型主要局限在北非和中东地区，5a主要分布在南非，6型主要分布在东南亚和来自该地区的静脉注射吸毒人群及移民中^{[2, 3, 4, 5]}。我国HCV基因型以1b和2a亚型多见，但不同区域HCV基因型的构成具有较大差异。一些地区的基因型分布较为特殊，如云南省以3b为主，广西壮族自治区以6a为主，在广东省及香港特别行政区6a亚型取代2a成为第二亚型^[6]。HCV基因型在不同人群中的分布也存在差异，有偿献血人群和透析人群HCV基因型较单一，主要为1b和2a；静脉注射吸毒人群中除1b和2a外，3a、3b和6a也占一定比例。

本研究在昆明市静脉注射吸毒人群中检测到HCV的3种基因型中的5种亚型。其中以3型为主，3b和3a两种亚型合计占79.2%；其次为6型，6n和6a两种亚型合计占17.6%；另外一种亚型1b占3.2%。以往研究报道，3a和3b亚型主要流行于云南省和新疆维吾尔自治区的静脉注射吸毒者中，6型也主要流行于云南省静脉注射吸毒人群人员中^[7]。本研究中，3b亚型的毒株的基因距离最大，其次是3a；而1b和6n的基因距离较小，提示该亚型在人群中流行时间较长，存在多次进入的可能；也说明了3型是该人群中的传统毒株，而1b和6n在该人群中的传播较晚。

相关的HCV基因进化分析提示，3a在国内可能有3个独立的起源，一个是在西北的新疆维吾尔自治区，一个是在西南的云南省，还有一个是在中南地区^[8]。在西北地区，3a可能是通过静脉注射吸毒人群从巴基斯坦进入我国新疆维吾尔自治区，再从新疆地区向国内其他地区传播^[9]；但3a在云南地区的起源，可能直接来源于巴基斯坦，也可能从巴基斯坦通过我国云南周边国家进入，因为中亚的毒品基地“新月湾”和东南亚的毒品基地“金三角”存在着人员往来，但目前还没有明确的证据。而基因进化分析表明3b在国内的起源比较单一，即从西南地区向西北和国内其他地区传播^[8]，这与国内陆上毒品运输路线一致，也与IDUs中HIV-1的CRF07_BC的传播方向一致^[10]。最近的研究提示，6a可能起源于越南，分别进入我国云南省和广西壮族自治区，云南省6a主要在IDUs中传播，经广西壮族自治区6a进入了周边省份，由于尚未明确的原因在广东地区形成了流行^[11]。针对6n的进化分析表明，6n可能起源于泰国和缅甸，通过IDUs经云南省向国内其他地区传播^[12]。基因距离在一定程度上可以提示某亚型的流行时间长短，本研究中昆明地区IDUs中3a、3b和6a亚型的基因距离大于1b和6n亚型的基因距离，提示3a、3b和6a在该人群中流行时间较长，而1b和6n可能较晚进入。

HCV基因型与丙型肝炎的预后和治疗密切相关。根据2009年美国肝病研究学会（AASLD）的《丙型肝炎的临床实践指南》，HCV感染者在开始抗病毒治疗前应检测HCV的基因型^[13]。在以干扰素为基础的治疗中，不同的基因型治疗效果有较大的差异。1型的持续病毒学应答最差，4型次之；而2、3型的持续病毒学应答较好。此外，HCV基因型对抗病毒治疗的疗程和药物剂量的选择也有指导作用。相比1型，2和3型的治疗疗程较短，利巴韦林的剂量较小。在昆明市IDUs中，3型是主要的基因型，相对来说属于治疗效果比较好的，积极开展筛查和治疗可收到很好的效果。

综上所述，IDUs推动了HCV在云南省的传播，由于特殊的地理位置，使得流行于周边国家的HCV基因型进入我国云南省，形成明显区别于其他地区的HCV基因型分布特征。今后，还需在云南省其他人群中监测HCV基因型的分布及变化特征，进一步明确HCV的传播趋势，找到控制HCV传播的有效途径。