近年来，我国HIV/AIDS病例数逐年上升，HIV感染途径也逐渐变化。性传播，包括异性性传播和同性性传播，成为HIV感染的主要途径。监测数据显示，MSM导致HIV感染快速上升。MSM导致的HIV感染在2005年仅占报告病例的0.3%，2009年为14.7%，2011年上升至17.4%。在2011年新发感染中，MSM导致的HIV感染高达29.4%^[1]，同性性传播已成为我国HIV传播的主要途径之一。

北京作为中国的政治、文化、经济中心，外来人口和流动人口多，MSM人群估计数也高于其他城市。研究显示，北京MSM中HIV-1的感染率在2002年时为3.1%^[2]，2006年升至4.8%^[3]，2010年则达到6%左右，明显高于其他城市。近年来，针对北京MSM人群HIV流行特征的研究越来越多，但多为血清学和简单分子流行病学研究，本研究拟利用Bayesian进化理论重建北京地区MSM人群中HIV系统发育关系，进行群体动态研究，深入分析北京MSM人群中流行的HIV毒株与其他毒株的关系，阐明北京地区MSM人群中流行毒株动态变化过程，为艾滋病行为干预提供切入点，为我国艾滋病防控工作提供数据信息。 材料与方法

1. 序列来源：研究中北京MSM人群流行的部分HIV毒株序列由本实验室获得，其他序列均来自Los Alamos HIV Database（www.hiv.lanl.gov）。选择的序列信息包含取样时间、取样城市、传播途径以及序列的亚型。所有序列经过初步整理后选择最终序列。

2. 系统发育树：使用muscle v3.1.1软件对序列进行比对，BioEdit 7.1.1软件对序列进行编辑校正，jModel Test v0.1^[4]软件选择分析序列的碱基替代模型，PhyML 3.0软件aLRT SH-Like方法构建系统发育树^{[5, 6]}。

3. Bayesian coalescent Markov Chain Monte Carlo（MCMC）进化分析：使用BEAST软件分析，根据jModel Test运算结果选择碱基替代模型，根据Bayesian因子选择分子钟模型，MCMC链计算80 000 000次，每8 000次取样^{[7, 8]}。运算结果使用Tracer v1.5软件分析，使用TreeAnnotator v1.7.5软件构建Maximum clade credibility tree（MCC树），使用FigTree 1.3.1软件查看和编辑MCC树。 结 果

1. 序列收集和分析数据系列的建立：本实验室共获得北京MSM人群中HIV gag区基因序列80条，包含CRF01_AE亚型、CRF07_BC亚型、B亚型毒株。检索数据库，发现位于HIV基因组的906～1 446位（使用国际标准株HXB2定位）的基因序列最多。通过整理下载序列合并实验室已有序列，共获得来自中国背景信息明确的HIV基因序列778条，包含CRF01_AE亚型、CRF07_BC亚型、B亚型。其中北京MSM人群HIV-1基因序列237条、北京市其他传播途径人群HIV-1基因序列114条，非北京地区MSM人群HIV-1基因序列166条、非北京地区其他传播途径人群HIV-1基因序列261条（表 1）。共收集北京MSM人群的HIV-1毒株基因序列（gag区540 bp）237条，其中，CRF01_AE亚型毒株为151条（占63.7%）；CRF07_BC亚型毒株为19条（占8.0%）；B亚型毒株为67条（占28.3%）。

表 1 北京MSM系统发育分析序列统计表

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2. 进化关系分析：为了解北京MSM人群与异地MSM人群、其他传播途径人群间HIV-1的进化关系，将获得的778条序列与Los Alamos HIV Database中A～J、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC共19条国际标准亚型参考序列进行系统进化分析，构建ML系统发育树（图 1）。将系统发育树中SH值≥90%^[5]且序列数量≥40条定义为簇，将北京MSM序列占总序列数≥40%的簇定义为北京MSM簇。本研究共发现6个大簇，包括B亚型2个簇、CRF07_BC重组型1个簇、CRF01_AE重组型3个簇。分析显示：B亚型的2个簇分别为欧美B亚型和Thai B亚型，来自北京MSM的序列只有3例位于Thai B亚型簇中，其他全部位于欧美B亚型簇（占该簇序列数的72%）中，说明北京MSM人群中流行的B亚型毒株与我国有偿献血人群中流行的B亚型毒株不同，而与欧美等国家MSM人群中流行的B亚型毒株相似，提示二者具有很近的亲缘关系。在CRF01_AE亚型的3个簇中，北京MSM人群的序列全部位于CRF01_AE-1和CRF01_AE-2簇。分析显示，CRF01_AE-1和CRF01_AE-2簇均是以MSM人群序列为主（分别占84%和77%），但CRF01_AE-1簇中北京MSM所占比例（90条，63%）高于CRF01_AE-2簇（31条，41%），差异有统计学意义（P≤0.05，χ²＝9.2972）。见表 2。

表 2 ML树中成簇序列背景信息

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注：a 异性传播； b 其他传播途径，包括静脉吸毒、血液传播、母婴传播 图 1 PhyML 3.0 aLRT SH-like构建ML系统发育树

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3. 进化特征：HIV进化特征分析可以有效的追溯其传入时间，研究传播事件对疫情的影响。本研究利用BEAST 1.7.5软件计算以北京MSM人群HIV毒株为主的3个传播簇的突变速率与祖先毒株传入时间（the time of most recent common ancestor，tMRCA）。结果显示：CRF01_AE两簇传入北京MSM人群的时间均为2001年左右（表 3、图 2），但两簇的突变速率存在明显差异，CRF01_AE-1簇突变速率为7.52E-03（nucleotide substitutions/site/year），95%HPD（highest posterior density）为5.34E-03～9.76E-03，明显高于其他两簇（表 4）。针对B-1簇的分析显示：欧美B亚型毒株是通过3次独立事件传入北京MSM人群（在进化树中分为3小簇），传入时间分别为1991年3月（1984年7月至1997年2月）、1994年1月（1990年5月至1999年3月）、1994年12月（1989年5月至1998年4月），但3簇的突变速率差异无统计学意义。

表 3 北京MSM簇的tMRCA

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表 4 北京MSM簇的突变速率

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注：红色树枝为北京MSM、蓝色树枝为非北京地区MSM、蓝绿色树枝为北京其他传播途径；灰色底纹标注3次输入事件为clu-a、clu-b、clu-c，后验概率≥95% 图 2 BEAST 1.7.5构建MCC树，推断CRF01_AE-1、CRF01_AE-2、B-1北京MSM簇tMRCA

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4. 流行特征分析：基于合并理论的系统进化分析可以根据序列重塑流行历史。本研究使用Bayesian Skyline模型^[9]，重塑北京MSM人群HIV毒株的流行历史，使用Birth-Death Basic Reproductive Number模型^[10]分析了各簇毒株流行人群再生指数（Reproductive Number，R0），以推断各簇毒株流行对北京MSM人群HIV流行的影响。Bayesian Skyline Plot结果显示：CRF01_AE-1簇的感染人群在2005－2007年间出现了快速增长，而CRF01_AE-2簇的感染人群一直处于平稳状态，B-1簇在2005年以后也一直处于相对平稳状态（图 3），说明CRF01_AE-1簇毒株对于2005年之后北京MSM人群中HIV的播散贡献较大。Birth-Death Basic Reproductive Number模型推断北京MSM簇的再生指数显示：CRF01_AE-1簇的R0值为4.205 7（95%CI：1.946 8～6.985 6），明显大于CRF01_AE-2簇的2.921（95%CI：1.569 5～4.439 1）（表 5），也说明CRF01_AE-1簇的传播速度要快于CRF01_AE-2簇。

表 5 北京MSM簇的R₀值

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注：虚线之间为两簇同一时间段内群体动态变化情况 图 3 BEAST 1.7.5重建CRF01_AE-1、CRF01_AE-2、B-1北京MSM簇群体动态

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本文利用Bayesian合并理论、系统发育等生物信息学方法对北京MSM人群中HIV-1流行情况进行分析，这种基于序列的分析方法可以减小抽样误差导致的结果偏倚，更深层次的挖掘该人群中HIV-1流行特点。合并理论是一个分析子代与祖先关系的模型，在大群体中依靠少量样本推断遗传谱系的分布以及群体历史，同时作为一个非连续的至简的假设自然进化的遗传谱系模型在Bayesian 分析中常作为先验使用^{[9, 11, 12]}。Bayesian Evolutionary Analysis by Sampling Trees（BEAST）是一款基于Bayesian合并理论利用MCMC算法分析基因序列的软件平台^{[13, 14]}。本文运用BEAST分析北京MSM人群中HIV-1的流行及进化特征，通过北京MSM人群的基因序列推断这个群体的进化历史以及群体动态。

男男性行为是HIV传播的主要高危行为之一，针对MSM人群的防控对有效控制HIV播散有重要意义。我国MSM人群估计超过1 800万人^[15]，而且该人群中HIV-1感染率高达6.5%^[16]，阐明该人群中HIV的亚型分布、传播方式和流行趋势可以为我国艾滋病防控提供重要信息。分子流行病学研究显示我国主要流行HIV-1毒株为CRF07_BC、CRF08_BC、CRF01_AE以及B’亚型。早期研究表明，我国MSM人群中主要流行毒株为CRF07_BC、CRF01_AE以及B亚型，B亚型毒株为优势毒株。本研究发现：CRF01_AE是北京MSM人群中流行的HIV-1主要基因型（63.7%），其所占比例显著高于B亚型（28.3%）。在本研究中，系统进化分析显示B亚型毒株传入北京MSM人群的时间较早（20世纪90年代初期），但增长速度较慢，而且在2005年左右B亚型毒株在北京MSM人群中开始处于平稳状态；CRF01_AE亚型毒株则出现快速增长，并最终取代B亚型毒株成为优势毒株，有力佐证了之前Wang等^[17]的研究结论。

20世纪90年代初期CRF01_AE亚型毒株由越南、缅甸经性传播与静脉吸毒传播进入我国云南省、广西壮族自治区，然后主要通过异性传播向东南沿海和西南边境扩散^{[18, 19, 20, 21, 22]}。性传播是CRF01_AE亚型毒株最主要的传播方式。本研究中北京MSM序列全位于CRF01_AE-1簇与CRF01_AE-2簇，说明该簇之中其他人群与北京MSM人群联系紧密存在流行病学联系，特别是异性性传播人群，提示毒株可能通过异性性传播向普通人群扩散。CRF07_BC簇中北京MSM的序列与来自其他传播途径的HIV序列交错在一起，提示CRF07_BC毒株在MSM人群中尚未形成局部的快速传播。我国MSM人群由于受道德观念、家庭压力、社会意识等影响，部分人群呈现双性恋，增加了普通人群感染HIV-1的风险，使得防控形势也更加复杂。

MSM人群与其他艾滋病高危人群不同，在其人群内传播已不受地域限制。研究发现以北京MSM人群为主的HIV毒株簇中也包含辽宁、河北、河南、安徽、江苏等地MSM人群，以省份为单位划分的空间已经不足以完全区分MSM人群特征，MSM人群的这种迁徙特征加大了HIV-1统筹防控的难度。针对毒株簇的深入分析显示：尽管CRF01_AE-1簇与CRF01_AE-2簇主要由北京MSM人群组成（表 2），但CRF01_AE-1簇中北京MSM人群比例更高、异性传播人群比例更低，说明当地MSM人群更倾向于单性恋。根据对突变速率推算，CRF01_AE-1簇突变速率明显高于CRF01_AE-2簇，说明该簇人群中HIV-1 CRF01_AE毒株受到的免疫压力更大，发生的传播事件更多。再生指数的计算则证实了这个推论，CRF01_AE-1簇人群再生指数显著大于CRF01_AE-2簇，说明在取样的时间段内CRF01_AE-1簇中HIV-1 CRF01_AE毒株产生了更大的流行。群体动态重建中CRF01_AE-1簇人群在2005－2007年间发生快速上升，印证了CRF01_AE-1簇感染人群较CRF01_AE-2簇增长迅速的推论。综上，深入分析CRF01_AE-1簇人群的流行病学特点并对其进行有针对性的行为干预，对减少北京市MSM人群中HIV的传播有重要意义。