近年来在细菌中发现的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）能抵御外源遗传物质入侵^[1]。CRISPR系统包括重复序列、间隔序列和前导序列，间隔序列是核心，呈现多态性，能反映曾经入侵细菌的外源遗传物质，在不同菌株间分布不同^[2]。CRISPR有免疫记忆和防御功能，当外源基因第一次入侵细菌时，CRISPR识别和整合前间隔序列（protospacer），形成新的间隔序列，当外源基因再次侵袭时，CRISPR识别外源基因、转录间隔序列和部分重复序列，crRNA与trans-activating crRNA（tracrRNA）、Cas 蛋白结合形成复合体，破坏入侵的外源基因^[3]，细菌CRISPR可识别与间隔序列相同的外源遗传物质，并启动免疫防御。志贺菌能导致细菌性痢疾（菌痢）^[4]。菌痢是全球都存在的公共卫生问题，尤其对发展中国家造成重大危害，在我国属于乙类传染病，发病率居我国甲乙类传染病第3位，是传染病控制的重点^[5]。按血清分型志贺菌分为4群：福氏、宋内、痢疾和鲍氏。发达国家流行的主要是宋内志贺菌，而我国以福氏志贺菌为主^[6]。我国CRISPR相关研究较少^[7]，探索志贺菌中CRISPR的分子流行病学特征具有重要意义。 材料与方法

1. 菌株：52株志贺菌均为河南省分子医学重点实验室收集保存，1996年江西分离株6株，均为福氏志贺菌。河南分离株41株（福氏志贺菌28株、宋内志贺菌11株、痢疾志贺菌2株），其中1998年2株，1999年1株，2000年6株，2001年7株，2003年2株，2004年3株，2005年3株，2006年5株，2007年2株，2008年10株。2013年北京分离株5株，均为福氏志贺菌。

2. 试剂：诊断血清购自卫生部兰州生物制品研究所。胰蛋白胨、酵母浸粉（英国Oxoid公司）。细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR相关试剂和100 bp DNA Ladder购于上海莱枫生物科技有限公司。

3. 引物：从GenBank和CRISPR Database数据库中查询志贺菌CRISPR基因相关序列，S1、S2、S3、S4为CRISPR Database数据库中已经发现的志贺菌CRISPR位点，选择保守序列，利用Primer 5.0设计引物，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成（表 1）。

表 1 志贺菌CRISPR系统相关引物

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4. PCR反应：以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系：三蒸水19 μl，2×Taq PCR Master Mix 25 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA 4 μl，共50 μl。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，32 个循环；72 ℃ 10 min。取5 μl PCR 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像仪观察结果并照相。

5. 核酸序列分析：PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，用CRISPR Finder对志贺菌的CRISPR进行比对。

6. 统计学分析：用SPSS 17.0软件进行统计学检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 结 果

1. 志贺菌CRISPR位点分布：志贺菌4个CRISPR位点的阳性率分别为33. 69%（S1）、50.00%（S2）、82.69%（S3）和73.08%（S4）；每个CRISPR位点有1～3个间隔序列，S1和S2仅在个别菌株有重复序列退化，在2株志贺菌发现了新的S3重复序列，S4的间隔序列呈现多态性，有4种不同模式（表 2）。

表 2 志贺菌中CRISPR位点的分子分布

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2. 志贺菌中CRISPR的重复序列和间隔序列：志贺菌CRISPR按照重复序列和间隔序列分成11组，其中S1包括2种亚型，S2包括3种亚型，S3包括2种亚型，S4包括4种亚型（表 3）。

表 3 志贺菌CRISPR的重复序列和间隔序列

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3. 志贺菌CRISPR与菌株分离时间的关系：河南分离株以分离时间M（2004年）作为界点分组，2004年及以前分离株21株，为A组；2004年以后分离株20株，为B组。A组包括14种CRISPR亚型，共获得95个间隔序列；B组包括7种CRISPR亚型，共获得68个间隔序列。6株江西分离株的CRISPR亚型：0110型2株，0111型1株，0011型1株，1111型1株，0002型1株。5株北京分离株的CRISPR亚型：0110型2株，0010型1株，0112型1株，0114型1株。 2004年前后分离的河南志贺菌S1分布差异有统计学意义（P＜0.05），2004年后分离的菌株中均未检出该位点；S2、S3 和S4在两组中的分布差异无统计学意义（表 4）。

表 4 河南福氏志贺菌CRISPR在时间分布上的差异

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CRISPR偕同Cas蛋白发挥免疫抑制作用，已有研究显示，志贺菌中广泛存在Cas1和Cas2蛋白^[8]，提示志贺菌中可能存在CRISPR系统。间隔序列与噬菌体、质粒等外源基因具有同源性^[1]，记录了外源基因入侵细菌的过程，能反映细菌的进化史。本研究在志贺菌中发现了不同的CRISPR亚型，提示曾入侵的外源基因不同，发现志贺菌CRISPR各位点的间隔序列较少，以1～2个为主。相对于大肠埃希菌，志贺菌含有的间隔序列较少，可能与志贺菌的生存环境有关，志贺菌多寄生于人的结肠和直肠黏膜，环境中噬菌体较少^[9]。4个CRISPR位点在志贺菌中均被检出，但是不同位点的CRISPR阳性率不同，提示志贺菌不同的CRISPR位点其在获取间隔序列的能力上有差异，其在免疫防御的作用和地位也不同，深入研究间隔序列有助于更深刻地理解细菌的进化机制。

河南分离的福氏志贺菌S1在时间分布上有差异，2004年以后分离的菌株中均未检出该位点，可能是与S1的间隔序列同源的外源基因对志贺菌的危险降低，细菌通过删除一些相对古老和无用的间隔序列，保证细菌基因组长度的稳定；此外，志贺菌多寄生于人的结肠和直肠黏膜，其生存环境中噬菌体较少，而抗生素对其的威胁更大，相关研究表明细菌的耐药程度和CRISPR位点呈负相关，同时CRISPR能限制耐药基因在细菌间的传播^[10]。随着噬菌体的危害降低和抗生素威胁的增加，志贺菌通过丢失CRISPR位点以降低其对外源基因的抑制，从而有利于耐药基因通过水平转移在细菌间扩散。而S2、S3和S4没有差异，说明志贺菌中CRISPR各位点的稳定程度不同，有些CRISPR位点的间隔序列相对稳定，而有些进化较快。相对于分离时间较早的志贺菌，分离时间较晚菌株含有的间隔序列更少，提示志贺菌随着时间的推移会丢失一些间隔序列，与其生活的环境密切相关。由于本研究的菌株较少，有一定的局限性。